①  提前 24 小時(shí)在 96 孔板或 24 孔板中接種細胞 8 孔，接種量以第二天長(cháng)成 25%單層為宜，置 CO2 孵箱中 37℃培養過(guò)夜。

     ② 將培養液換成含抗生素的培養基， 抗生素濃度按梯度遞增0,（50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml）。

     ③ 培養 10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為 400-800μg/ml，篩選穩 定表達克隆時(shí)可比該濃度適當提高一個(gè)級別維持時(shí)使用篩選濃度的一半。

     2．轉染按前面的步驟進(jìn)行。

     3．轉染 72 小時(shí)后按 1: 10 的比例將轉染細胞在 6 孔板中傳代，換為含預試驗中 確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6 孔板內可見(jiàn)單個(gè)細胞，繼續培養可見(jiàn)單個(gè) 細胞分裂繁殖形成單個(gè)抗性集落，此時(shí)可用兩種方法挑選單克隆。

     ① 濾紙片法：用消毒的 5x5mm 濾紙片浸過(guò)胰酶，將濾紙片貼在單細胞集落上 10-15 秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于 24 孔板中繼續加壓培養。 細胞在 24 孔板中長(cháng)滿(mǎn)后轉入 25cm2 培養瓶中，長(cháng)滿(mǎn)后再轉入 75cm2 培養瓶中培養。

     ② 有限稀釋法：將細胞消化下來(lái)后做連續的 10 倍稀釋?zhuān)?0-2-10-10） ，將每 一稀釋度的細胞滴加到 96 孔板中培養，7- 10 天后，選擇單個(gè)克隆生長(cháng)的孔再一次進(jìn)行克隆。

     4. ELISA或 Westernblot檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的 表達水平存在差異因此可同時(shí)挑選多個(gè)克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。