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免疫組織化學(xué)反應結果的判斷標準

   免疫組織化學(xué)技術(shù)自開(kāi)展以來(lái)日益受到人們的重視,已被廣泛地運用在病理診斷及研究領(lǐng)域。敏感的免疫酶標過(guò)氧化物酶一抗過(guò)氧化物酶(PAP)法和親和素一生物素一過(guò)氧化物酶復合物(ABC)法的出現,使病理工作者能夠通過(guò)常規福爾馬林固定和石蠟包埋的組織切片或細胞涂片檢測各種抗原成分從而識別腫瘤細胞,并為腫瘤的組織來(lái)源、分類(lèi)和診斷提供了科學(xué)的客觀(guān)依據,開(kāi)辟了人類(lèi)認識腫瘤和腫瘤病理診斷的新途徑。近年來(lái)癌基因和抑癌基因日益成為人們研究腫瘤的熱門(mén)領(lǐng)域,最初采取的是分子生物學(xué)方法,癌基因蛋白產(chǎn)物的出現使我們可以通過(guò)免疫組織化學(xué)這個(gè)簡(jiǎn)便而快速的方法來(lái)研究癌基因和抑癌基因,進(jìn)而研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制,并判斷預后,為免疫組織化學(xué)的應用開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。


一、判斷免疫組織化學(xué)反應結果應有一個(gè)統一的標準


    免疫組織化學(xué)工作的開(kāi)展也遇到一些問(wèn)題,其中最突出的就是免疫組織化學(xué)判斷結果上的不一致。我們經(jīng)常碰到這種情況:讀片會(huì )上某些作為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性片打出的幻燈引起爭議。在日常工作中,對同一張免疫組織化學(xué)切片,有人說(shuō)陽(yáng)性,也有人說(shuō)陰性。這造成了日常工作中一定的混亂。每張切片中可有數目不等的陽(yáng)性細胞.而其陽(yáng)性強度也各不相同,因此一張切片中究竟有多少細胞陽(yáng)性才算免疫組織化學(xué)最終結果的陽(yáng)性,陽(yáng)性強度又如何劃分,是免疫組織化學(xué)結果判斷的最為關(guān)鍵的問(wèn)題。因為陽(yáng)性標準不同,同一批實(shí)驗所得出的完全可以是另一個(gè)診斷,另一個(gè)研究結果。


    在判斷標準上,還沒(méi)有一個(gè)統一的標準或權威性的結論。目前主要有三種方法:(l)在判斷中只考慮陽(yáng)性細胞所占的百分比,按不同的百分比分級;(2)在判斷中只考慮陽(yáng)性細胞的染色強度,按不同的染色強度分級;(3)在判斷上兼顧陽(yáng)性染色的強度及數量。


    在只考慮陽(yáng)性細胞所占百分比的判斷標準中,究竟多少細胞陽(yáng)性才算最終結果的陽(yáng)性分歧很大。有些人主張只要有一個(gè)細胞陽(yáng)性,就算最終結果陽(yáng)性。他們認為在腫瘤的診斷中,只要有一個(gè)細胞陽(yáng)性就說(shuō)明此腫瘤細胞有向該方向分化的潛能。如有的惡性黑色素瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、卵巢轉移性癌等可由于大部分細胞分化很差,所以呈陽(yáng)性的只是少數甚至個(gè)別的細胞,但這個(gè)別細胞恰恰反應了腫瘤的組織來(lái)源。而在癌基因的研究中某些癌基因蛋白的表達只要較少量就可影響患者的預后。鑒于上述兩個(gè)原因,所以有相當一部分學(xué)者采用看到陽(yáng)性細胞就算最終結果陽(yáng)性這個(gè)標準。另外,也有很多學(xué)者分別以1%、5%、10%、20%、25%和50%等作為臨界點(diǎn)來(lái)判斷陽(yáng)性。也有許多學(xué)者在判斷免疫組織化學(xué)結果時(shí)僅以染色強度為標準,往往是根據陽(yáng)性染色的有無(wú)及強度來(lái)判斷。通??煞譃?(-)即無(wú)陽(yáng)性染色;(士)即可疑陽(yáng)性,(+)即弱陽(yáng)性,(++)即中等陽(yáng)性,(+++)即強陽(yáng)性等。


    在兼顧陽(yáng)性染色的強度及數量的判斷標準中,也有各種方法。第四軍醫大學(xué)趙彤等采用著(zhù)色強度積分與數量積分相加的方法。他們將陽(yáng)性細胞百分比分成5級。無(wú)陽(yáng)性細胞為0分,陽(yáng)性細胞≤25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分。著(zhù)色強度無(wú)色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。著(zhù)色強度積分與數量積分相加:0分為(-),2-3分為(士),4-5分為(+),6-7分為(++),其中(+)和(++)判為陽(yáng)性。也有作者將數量和強度組合起來(lái)判斷。數量上陽(yáng)性細胞占20%-70%為1,>70%為2;強度上弱陽(yáng)性為a,強陽(yáng)性為b,兩者的組合1a為弱陽(yáng)性,1b或2a為中等程度陽(yáng)性,2b為強陽(yáng)性。Rem-mele和Stegner提出的免疫反應積分(IRS)打分法采用的是染色強度(Sl)和陽(yáng)性細胞百分比(PP)的乘積,即IRS=51又PP。51可分為4級,即。級為未見(jiàn)陽(yáng)性細胞即陰性,1級弱陽(yáng)性,2級中等陽(yáng)性,3級強陽(yáng)性。PP可分為5級,即0級為陰性,1級簇10%,2級11%-50%;3級51%~80環(huán),4級>80%。當SI與PP的乘積>3分時(shí)才算免疫反應(+)。


二、幾個(gè)需要注意的問(wèn)題


    從上述情況可以看出,免疫組織化學(xué)結果的判斷標準有待于進(jìn)一步統一。當然在判斷結果上,除了判斷標準,還有其他一些需要注意的問(wèn)題。下面談?wù)勎覀兊目捶ā?/span>

   1.陽(yáng)性成分的判斷:通常所指的陽(yáng)性,是指所需研究的細胞陽(yáng)性。在腫瘤中就是指腫瘤細胞的陽(yáng)性。其他間質(zhì)細胞、炎癥細胞等不應計入。在判斷中,出血壞死區、受擠壓的組織及切片邊緣不應計入。


   2.陽(yáng)性細胞的定位:應當清晰而準確。如應是細胞核陽(yáng)性的,僅在細胞質(zhì)或膜上出現陽(yáng)性的細胞不應算做陽(yáng)性。

   3.觀(guān)察視野的大小:應先用低倍鏡,后用高倍鏡,且不少于5個(gè)高倍視野或1000個(gè)細胞。有些低倍鏡觀(guān)察到的細胞并非真正陽(yáng)性。通過(guò)高倍鏡仔細觀(guān)察,可以剔除一些定位不準確的陽(yáng)性細胞及一些并非所需研究的細胞的陽(yáng)性。


   從上述情況可以看出,免疫組織化學(xué)結果的判斷標準有待于進(jìn)一步統一。當然在判斷結果上,除了判斷標準,還有其他一些需要注意的問(wèn)題。下面談?wù)勎覀兊目捶ā?/span>


   4.與背景的對比:并非細胞內出現棕褐色即為陽(yáng)性。很重要的一點(diǎn)在于細胞和周?chē)尘暗膶Ρ?。纖維結締組織在顯色時(shí)通常相當容易著(zhù)色,表現為一片棕黃(尤其在運用多克隆抗體時(shí),背景往往較深)。此時(shí)只有當細胞的棕黃色程度明顯高出背景者才為陽(yáng)性。在操作過(guò)程中,也可運用一定的方法來(lái)降低背景著(zhù)色,如染色前用蛋白酶消化、H2O2:和正常血清保護等。近年來(lái)的親和素一生物素標記鏈霉菌素(LSAB)一微波免疫組織化學(xué)染色法,比用蛋白酶消化切片陽(yáng)莊率和陽(yáng)性強度均有提高,且更不容易引起非特異染色,背景更加清晰。這是一個(gè)值得推廣的好方法。


三、陽(yáng)性的判斷標準
  

    在癌基因和抑癌基因的判斷標準上,曾有人建議將免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法的結果加以比較來(lái)設定標準。這有一定的參考價(jià)值。有文獻報道,若p53的免疫組織化學(xué)標準定的太低,則DNA測序不應有陽(yáng)性結果。但這個(gè)方法也有很大的局限性。因為免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法各有其特點(diǎn),它們的結果并不完全一致。Sgorgen等比較了p53。DNA測序和免疫組織化學(xué)的結果,發(fā)現用免疫組織化學(xué)方法判斷p53突變約有33%的假陰性和30%的假陽(yáng)性。Elledge認為p53免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性不一定是p53突變的結果,如正常細胞周期波動(dòng)、對DNA損傷的反應、與其它細胞內蛋白的結合、P53負反饋調控機制的障礙均可導致p53蛋白檢測陽(yáng)性。分子生物學(xué)測得p53突變,免疫組織化學(xué)不一定表現為陽(yáng)性,因為在伴有框架改變或編碼序列無(wú)義突變時(shí),p53蛋白缺少、縮短或不穩定,免疫組織化學(xué)方法反而檢測不到p53蛋白。但在某些啟動(dòng)子區域或特殊區域發(fā)生的p53突變,DNA測序可檢測不出,而免疫組織化學(xué)卻表現為陽(yáng)性。我們認為,無(wú)論是那些用于診斷和鑒別診斷的指標,還是癌基因、抑癌基因蛋白、受體或細胞增殖指標,都應有一個(gè)統一的判斷標準。這樣對病理診斷才有價(jià)值,日常的研究工作才真正得以統一。


     我們認為陽(yáng)性細胞應首先符合下列標準:(1)切片染色對比度好,背景清晰;(2)陽(yáng)性細胞定位要準確;(3)出血、壞死、受擠壓的組織及切片邊緣不應作為判斷的依據。在符合這3個(gè)基本條件的前提下,我們建議采用下面的判斷標準。首先將染色強度打分:0分為無(wú)色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。(染色深淺需與背景著(zhù)色相對比)。再將陽(yáng)性細胞所占的百分比打分:0分為陰性,1分為陽(yáng)性細胞簇≤10%,2分為11%-50%,3分為51%-75%,4分為>75%。染色強度與陽(yáng)性細胞百分比的乘積>3分才算免疫反應(+)。這個(gè)方法兼顧到陽(yáng)性染色的強度和數量,且陽(yáng)性的最低標準需>3分,對免疫組織化學(xué)的基本質(zhì)量提出了一定要求,更為準確和客觀(guān)。


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