一、判斷免疫組織化學(xué)反應結果應有一個(gè)統一的標準
免疫組織化學(xué)工作的開(kāi)展也遇到一些問(wèn)題,其中最突出的就是免疫組織化學(xué)判斷結果上的不一致。我們經(jīng)常碰到這種情況:讀片會(huì )上某些作為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性片打出的幻燈引起爭議。在日常工作中,對同一張免疫組織化學(xué)切片,有人說(shuō)陽(yáng)性,也有人說(shuō)陰性。這造成了日常工作中一定的混亂。每張切片中可有數目不等的陽(yáng)性細胞.而其陽(yáng)性強度也各不相同,因此一張切片中究竟有多少細胞陽(yáng)性才算免疫組織化學(xué)最終結果的陽(yáng)性,陽(yáng)性強度又如何劃分,是免疫組織化學(xué)結果判斷的最為關(guān)鍵的問(wèn)題。因為陽(yáng)性標準不同,同一批實(shí)驗所得出的完全可以是另一個(gè)診斷,另一個(gè)研究結果。
在只考慮陽(yáng)性細胞所占百分比的判斷標準中,究竟多少細胞陽(yáng)性才算最終結果的陽(yáng)性分歧很大。有些人主張只要有一個(gè)細胞陽(yáng)性,就算最終結果陽(yáng)性。他們認為在腫瘤的診斷中,只要有一個(gè)細胞陽(yáng)性就說(shuō)明此腫瘤細胞有向該方向分化的潛能。如有的惡性黑色素瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤、卵巢轉移性癌等可由于大部分細胞分化很差,所以呈陽(yáng)性的只是少數甚至個(gè)別的細胞,但這個(gè)別細胞恰恰反應了腫瘤的組織來(lái)源。而在癌基因的研究中某些癌基因蛋白的表達只要較少量就可影響患者的預后。鑒于上述兩個(gè)原因,所以有相當一部分學(xué)者采用看到陽(yáng)性細胞就算最終結果陽(yáng)性這個(gè)標準。另外,也有很多學(xué)者分別以1%、5%、10%、20%、25%和50%等作為臨界點(diǎn)來(lái)判斷陽(yáng)性。也有許多學(xué)者在判斷免疫組織化學(xué)結果時(shí)僅以染色強度為標準,往往是根據陽(yáng)性染色的有無(wú)及強度來(lái)判斷。通??煞譃?(-)即無(wú)陽(yáng)性染色;(士)即可疑陽(yáng)性,(+)即弱陽(yáng)性,(++)即中等陽(yáng)性,(+++)即強陽(yáng)性等。
1.陽(yáng)性成分的判斷:通常所指的陽(yáng)性,是指所需研究的細胞陽(yáng)性。在腫瘤中就是指腫瘤細胞的陽(yáng)性。其他間質(zhì)細胞、炎癥細胞等不應計入。在判斷中,出血壞死區、受擠壓的組織及切片邊緣不應計入。
3.觀(guān)察視野的大小:應先用低倍鏡,后用高倍鏡,且不少于5個(gè)高倍視野或1000個(gè)細胞。有些低倍鏡觀(guān)察到的細胞并非真正陽(yáng)性。通過(guò)高倍鏡仔細觀(guān)察,可以剔除一些定位不準確的陽(yáng)性細胞及一些并非所需研究的細胞的陽(yáng)性。
從上述情況可以看出,免疫組織化學(xué)結果的判斷標準有待于進(jìn)一步統一。當然在判斷結果上,除了判斷標準,還有其他一些需要注意的問(wèn)題。下面談?wù)勎覀兊目捶ā?/span>
4.與背景的對比:并非細胞內出現棕褐色即為陽(yáng)性。很重要的一點(diǎn)在于細胞和周?chē)尘暗膶Ρ?。纖維結締組織在顯色時(shí)通常相當容易著(zhù)色,表現為一片棕黃(尤其在運用多克隆抗體時(shí),背景往往較深)。此時(shí)只有當細胞的棕黃色程度明顯高出背景者才為陽(yáng)性。在操作過(guò)程中,也可運用一定的方法來(lái)降低背景著(zhù)色,如染色前用蛋白酶消化、H2O2:和正常血清保護等。近年來(lái)的親和素一生物素標記鏈霉菌素(LSAB)一微波免疫組織化學(xué)染色法,比用蛋白酶消化切片陽(yáng)莊率和陽(yáng)性強度均有提高,且更不容易引起非特異染色,背景更加清晰。這是一個(gè)值得推廣的好方法。
三、陽(yáng)性的判斷標準
在癌基因和抑癌基因的判斷標準上,曾有人建議將免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法的結果加以比較來(lái)設定標準。這有一定的參考價(jià)值。有文獻報道,若p53的免疫組織化學(xué)標準定的太低,則DNA測序不應有陽(yáng)性結果。但這個(gè)方法也有很大的局限性。因為免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法各有其特點(diǎn),它們的結果并不完全一致。Sgorgen等比較了p53。DNA測序和免疫組織化學(xué)的結果,發(fā)現用免疫組織化學(xué)方法判斷p53突變約有33%的假陰性和30%的假陽(yáng)性。Elledge認為p53免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性不一定是p53突變的結果,如正常細胞周期波動(dòng)、對DNA損傷的反應、與其它細胞內蛋白的結合、P53負反饋調控機制的障礙均可導致p53蛋白檢測陽(yáng)性。分子生物學(xué)測得p53突變,免疫組織化學(xué)不一定表現為陽(yáng)性,因為在伴有框架改變或編碼序列無(wú)義突變時(shí),p53蛋白缺少、縮短或不穩定,免疫組織化學(xué)方法反而檢測不到p53蛋白。但在某些啟動(dòng)子區域或特殊區域發(fā)生的p53突變,DNA測序可檢測不出,而免疫組織化學(xué)卻表現為陽(yáng)性。我們認為,無(wú)論是那些用于診斷和鑒別診斷的指標,還是癌基因、抑癌基因蛋白、受體或細胞增殖指標,都應有一個(gè)統一的判斷標準。這樣對病理診斷才有價(jià)值,日常的研究工作才真正得以統一。