免疫組化方法（石蠟切片）

*重要提示：參考抗體說(shuō)明書(shū)選用合適的抗體稀釋液和抗原修復處理方法。IHC 方法：抗原修復緩沖液/抗體稀釋液

A. 所需溶液和試劑

1. 二甲苯

2. 無(wú)水乙醇（100% 和 95%，變性無(wú)水乙醇，組織學(xué)級）

3. 去離子水（dH2O）

4. 蘇木精（可選）

5. 漂洗（緩沖）液：

1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)：配制時(shí)，取 100 ml 10X TBS 加 900 ml 水稀釋至 1 升。加入 1 ml Tween-20，混勻。

10X Tris 緩沖鹽水 (10X TBS)：在 800 ml 蒸餾水中加入 24.2 g 三羥甲基氨基甲烷（Trizma base, C4 H11NO3）和 80 g 氯化鈉（NaCl）。用濃鹽酸將 pH 調節到 7.6，定容至 1 L。

6. 抗體稀釋液

a. SignalStain? 抗體稀釋液 #8112

b. TBST / 5% 正常山羊血清： 5 ml 1 X TBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

c. PBST / 5% 正常山羊血清： 5 ml 1 X PBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制時(shí)，取 100 ml 10X PBS 加 900 ml 水稀釋至 1 L。加入 1 ml Tween-20，混勻。

10X 磷酸鹽緩沖液 (10X PBS): 在 800 ml 水中加入 80 g 氯化鈉（NaCl）, 2 g 氯化鉀（KCl）, 14.4 g 磷酸氫二鈉（Na2 HPO4）和 2.4 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）。調整 pH 到 7.4，定容至 1 L。

7. 抗原修復：

a. 檸檬酸鹽：10 mM 檸檬酸鹽緩沖液：稱(chēng)取 2.94 g 二水合檸檬酸鈉（C6 H5Na3O7?2 H2O）溶解在 800 ml 水中。調整 pH 為 6.0，定容至 1 L。

b. EDTA: 1 mM EDTA: 稱(chēng)取 0.372 g EDTA (C10 H14N2O8Na2?2 H2O) 溶解在 800 ml 水中。調整 pH 為 8.0，定容至 1 L。

c. TE：10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制時(shí)，稱(chēng)取 1.21 g Trizma?堿（C4 H11NO3）和 0.372 g EDTA (C10 H14N2O8Na2?2 H2O) 溶解在 950 ml 蒸餾水中。調整 pH 到 9.0，然后用蒸餾水定容至到 1 L。

d. 胃蛋白酶：1 mg/ml，溶解在 pH 為 2.0 的 Tris 鹽酸緩沖液中。

8. 3% 過(guò)氧化氫：配制時(shí)，將 10 ml 30% H2O2 加入到 90 ml 蒸餾水中。

9. 封閉液：TBST/5% 正常山羊血清：5 ml 1X TBST 中添加 250 ?l 正常山羊血清。

10. 檢測系統：根據廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)使用。已有的檢測系統：

SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125注意: 如果本產(chǎn)品沒(méi)有使用本試劑優(yōu)化過(guò)，可能需要通過(guò)滴定法來(lái)確定最佳條件。

11. DAB 試劑或合適的底物：按產(chǎn)品說(shuō)明配制。

B. 脫蠟處理/再水化

注意：操作中任何時(shí)候都不要晾干玻片

1. 脫蠟處理/切片的水化：

a. 用二甲苯浸洗切片 3 次，每次 5 分鐘。

b. 用無(wú)水乙醇浸洗切片 2 次，每次 10 分鐘。

c. 用 95% 乙醇浸洗切片 2 次，每次 10 分鐘

2. 在蒸餾水中漂洗 2 次，每次 5 分鐘。

C. *抗原修復

注意：參考抗體說(shuō)明書(shū)選用合適的抗原修復緩沖液，按以下步驟操作。

1. 檸檬酸緩沖液處理：加熱浸泡在 10 mM pH 6.0 的檸檬酸鹽緩沖液中的玻片，使之維持在準沸騰的溫度（95-99°C）10 分鐘。取出放在實(shí)驗臺上自然冷卻 30 分鐘。

2. EDTA 處理：加熱浸泡在 1 mM pH 8.0 EDTA 溶液中的玻片，使之維持在準沸騰的溫度（95-99°C）15 分鐘。不需另加冷卻步驟。

3. TE 處理：加熱浸泡在 pH 9.0 的 10 mM TE/1 mM EDTA 溶液中的玻片，使之維持在準沸騰的溫度（95-99°C）18 分鐘。取出放在實(shí)驗臺上自然冷卻 30 分鐘。

4. 胃蛋白酶處理：37°C 消化 10 分鐘。

D. 染色

注意：查詢(xún)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦的抗體稀釋比例。

1. 切片用漂洗液洗兩次，每次 5 分鐘。

2. 浸泡在 3% H202 中孵育 10 分鐘

3. 用蒸餾水漂洗兩次，每次 5 分鐘。

4. 用漂洗液洗 5 分鐘

5. 在切片上滴加 100-400 μl 封閉液，室溫封閉 1 小時(shí)。

6. 去掉封閉液，每個(gè)切片上加 100-400 ?l 稀釋的一抗。4°C 孵育過(guò)夜。

7. 去掉抗體稀釋液。用漂洗液洗 3 次，每次 5 分鐘。

8. 根據廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)，用合適的檢測系統檢測。

9. 用漂洗液洗 3 次，每次 5 分鐘。

10. 加入 100–400 ?l DAB 或合適的底物，近距離檢測染色進(jìn)展。

11. 一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中。

12. 如有需要，將切片泡在蘇木精溶液中復染，按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。

13. 切片用蒸餾水洗兩次，每次 5 分鐘。

14. 切片脫水：

a. 在 95% 乙醇中孵育兩次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中孵育兩次，每次 10 秒。

15. 加上蓋玻片。

免疫組化方法（冰凍切片）

A. 所需溶液和試劑

1. 二甲苯

2. 無(wú)水乙醇（100% 和 95%，變性無(wú)水乙醇，組織學(xué)級）

3. 蘇木精（可選）

4. 固定劑：請參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)選取合適的固定劑。

a. 10% 中性福爾馬林

b. 丙酮

c. 甲醇

d. 3% 甲醛溶液：配制時(shí)，將 18.75 ml 16% 甲醛溶液加入到 81.25 ml 1X PBS 中。

5. 10X Tris 緩沖鹽水（10X TBS）：在 800 ml 蒸餾水中加入 24.2 g 三羥甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4 H11NO3）和 80 g 氯化鈉（NaCl）。用濃鹽酸將 pH 調節到 7.6。

6. 漂洗（緩沖）液：1 X Tris 緩沖鹽水（TBS）。100 ml 10 X TBS 加 900 ml 水至 1L。

7. 甲醇/過(guò)氧化氫：配制時(shí)，將 10 ml 30% H202 加入到 90 ml 甲醇中。保存在-20°C。

8. 封閉液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5% 正常山羊血清。配制時(shí)，將 500 ?l 山羊血清和 30 ?l Triton-X 100 加入到 9.5 ml 1X TBS 中。

9. 檢測系統：根據廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)使用。已有的檢測系統*。

10. DAB 試劑或合適的底物：按產(chǎn)品說(shuō)明配制。

B. 切片

1. 對于保存在-80°C 的樣品：切片前先從冰箱中取出放在-20°C 平衡 15 分鐘左右。這可以避免切片時(shí)樣品斷裂。

2. 將樣品切成大約 6-8 ?m 厚，鋪在帶正電性的玻片上。

3. 固定前，可以把切片攤開(kāi)放在實(shí)驗臺上風(fēng)干幾分鐘。（這有助于切片貼緊玻片）

C. 固定

注意：參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（抗體）選擇合適的固定劑

1. 玻片上的切片風(fēng)干后，選用如下合適的固定劑進(jìn)行固定。

a. 10% 中性福爾馬林：室溫 10 分鐘。立即進(jìn)行染色操作。

b. 冰丙酮：-20°C 10 分鐘。風(fēng)干。立即進(jìn)行染色操作。

c. 甲醇：-20°C 10 分鐘。立即進(jìn)行染色操作。

d. 3% 甲醛溶液：室溫 15 分鐘。立即進(jìn)行染色操作。

e. 3% 甲醛/甲醇：先在室溫下 3% 甲醛中固定 15 分鐘，然后在-20°C 的甲醇中固定 5 分鐘（中間不漂洗）。立即進(jìn)行染色操作。

D. 染色

1. 切片用漂洗液洗兩次，每次 5 分鐘。

2. 室溫下，浸泡在 3% H202/甲醇中孵育 10 分鐘

3. 用漂洗液洗兩次，每次 5 分鐘。

4. 在切片上滴加封閉液，室溫封閉 1 小時(shí)。

5. 按抗體說(shuō)明書(shū)的推薦比例將抗體稀釋在封閉液中。

6. 去掉切片上的封閉液，每個(gè)切片上加 100-400 ?l 稀釋的一抗。4°C 孵育過(guò)夜。

7. 去掉抗體。用漂洗液洗 3 次，每次 5 分鐘。

8. 根據廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)，用合適的檢測系統*檢測。

9. 用漂洗液洗 3 次，每次 5 分鐘。

10. 加入 100–400 ?l DAB 或合適的底物，近距離檢測染色進(jìn)展。

11. 一旦切片染色成功，立刻將玻片浸入水中。

12. 如有需要，將切片泡在蘇木精溶液中復染，按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。

13. 切片用蒸餾水洗兩次，每次 5 分鐘。

14. 切片脫水：

a. 在 95% 乙醇中孵育兩次，每次 10 秒。

b. 在 100% 乙醇中孵育兩次，每次 10 秒。

c. 在二甲苯中孵育兩次，每次 10 秒。

15. 加上蓋玻片