問(wèn)：我準備做病毒空斑實(shí)驗，不知到怎樣配置甲基纖維素覆蓋培養液，敬請各位指教 

       答：1、我是這么做的： 

  
       24孔板VERO，HSV1

       1）24孔板預板

       2）24h后，棄培養液，用hanks液洗1次

       3）接種病毒液0.1ml/孔

       4）放入37度5％CO2培養箱1h，期間每15min慢搖一次，使病毒充分吸附

       5）加入1％甲基纖維素（1ml/）孔覆蓋培養基，放入37度5％CO2培養箱繼續培養

       6）3天后，吸棄培養基

       7）加入5％甲醛1ml/孔固定4min，棄甲醛，加入結晶紫0.8ml/孔染色20min

       8）自來(lái)水緩緩沖洗染液，計算孔斑數 

       2、我的老師做空斑試驗也是用甲基纖維素，不過(guò)濃度是2%，配置方法是：甲基纖維素：3克溶于150ml蒸餾水中，最終濃度為2%；染色用的碘液：25g溶于500ml95%的乙醇中。最終濃度為5%做出的效果很好。不過(guò)甲基纖維素要提前很長(cháng)時(shí)間配置，大約2周，高壓后放入冰箱，使用前無(wú)菌操作加入培養液，混勻放入冰箱，過(guò)一天后再拿出，使勁搖勻，使纖維素達到一種勻質(zhì)的狀態(tài)，靜置至起泡完全消失后使用。 染色可以用中性紅0.1%（w/v)溫箱孵育2-3小時(shí)，若是6孔板每孔加1ml;傾倒后即可計數。

       問(wèn)：“1％甲基纖維素（1ml/）孔覆蓋培養基，放入37度5％CO2培養箱繼續培養”是指把1％甲基纖維素直接加入已放好培養基的孔里，還是甲基纖維素和培養基混好再加入細胞中？配方比例是什么？甲基纖維素要提前很長(cháng)時(shí)間配置，大約2周為什么？什么時(shí)候可以計數了？以什么為標準呢？ 

       答：1、1％甲基纖維素（1ml/）孔覆蓋培養基應是指按1ml/孔的量加甲基纖維素覆蓋培養基。甲基纖維素覆蓋培養基應該就是指Viscous medium,它是一種專(zhuān)門(mén)培養基。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是在普通細胞培養液里面添加了甲基纖維素來(lái)提供粘性,甲基纖維素應非營(yíng)養物質(zhì)。因甲基纖維素難溶，所以要先配并滅菌好甲基纖維素溶液。然后在無(wú)菌條件下往其中補加其他培養基所需成分，注意MEM 配的是10×的，這樣要加的MEM 溶液體積就少的多。我按protol配好Viscous medium其最后總體積約 400 ml，所以10× MEM只需40 ml。其他成分所加量按配400 ml 培養基換算就是了。所以甲基纖維素和培養基不是分開(kāi)的，甲基纖維素只是這種培養基里的一種成分而已。

       至于什么時(shí)候可以計數要看感染后CPE出現情況，這個(gè)要看具體測的病毒，剛開(kāi)始每天堅持觀(guān)察并計數就是了，直到?jīng)]新的斑出現，大概都應在一周內吧。這個(gè)做一遍就可摸索出來(lái)。

       2、我也用Viscous medium做病毒空斑實(shí)驗，甲基纖維素覆蓋培養液具體配方如下，供參考：In a glass bottle, combine 8.8 g methyl cellulose (4000 centipoise ,Sigma) with 320 ml distilled water. Stir with a large magnetic stirrer. Autoclave 30 min at 121 ℃, leaving the magnetic stirrer inside the bottle. Remove from autoclave while still hot and stir again until methyl cellulose has completely dissolved (usually a few hours).Add 40 ml 10× MEM or 10× DMEM, 40 ml FBS, 40,000 U penicillin, 40 mg streptomycin, and 4 ml of 1 M HEPES. Add L-glutamine and sodium bicarbonate according to the medium supplier's recommendations. Store up to 6 months at -20℃.配置此 Viscous medium 確實(shí)挺麻煩，所用試劑多， 甲基纖維素是難溶解，不過(guò)我按上述方法大概兩三天內也溶好了。只要配好了甲基纖維素溶液，其他步驟都簡(jiǎn)單了。

       問(wèn)：還想請教，不管用什么培養基，怎么滅菌？用高壓的話(huà) 瓊脂拿出來(lái)后很快就凝固了呀 要是高溫就加進(jìn)去 細胞會(huì )被燙死的，那個(gè)瓊脂稍微加熱溶解一下都很快凝固的，請指教。

       答：可用低熔點(diǎn)瓊脂糖呀，壓完后放在42度保溫培養基37度保溫，用時(shí)混合半小時(shí)內不會(huì )凝的。我做的空斑實(shí)驗就是用的低熔點(diǎn)瓊脂糖，效果很好。當然也是文獻推薦的因為我是做桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達系統的，上層覆蓋物只是防止病毒隨液體擴散。

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