1. 介紹

      包含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的過(guò)量表達已引起越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注。作為一個(gè)例子，非天然氨基酸的定點(diǎn)摻入，使關(guān)于蛋白質(zhì)結構和功能的化學(xué)假定的特異檢測成為可能。類(lèi)似地，具有新化學(xué)性質(zhì)的非天然氨基酸的定點(diǎn)摻入，可能使蛋白質(zhì)產(chǎn)生新的功能，如與酮基取代的氨基酸交聯(lián) [1] 。對整個(gè)蛋白質(zhì)的整體非天然氨基酸摻入，也可能導 致新的物理或功能性質(zhì)。例如，用硒代甲硫氨酸那樣的重原子類(lèi)似物代替甲硫氨酸，已成為 X 射線(xiàn)晶體學(xué)中得到差值圖（進(jìn)而得到位相，解析蛋白質(zhì)晶體結構——譯者注）的有用工具 [2] 。用非天然氨基酸整體地擾動(dòng)生物體的蛋白質(zhì)組，已被用來(lái)在實(shí)驗中探測基因編碼的進(jìn)化。細菌和噬菌體已適應于非天然氨基酸的摻入，并且為這些進(jìn)化轉變所需要的突變的數量和類(lèi)型也已經(jīng)過(guò)檢驗 [ 3~6 ]。

      雖然有大量文獻涉及細菌在非天然氨基酸環(huán)境中的生長(cháng)（如用色氨酸類(lèi)似物，見(jiàn)參考文獻 [ 7~11 ] )，但其中大部分只是敘述技術(shù)，而沒(méi)有考慮工藝規程的改變怎樣影響實(shí)驗結果。為此，我們在這里提供一些更詳盡的方法。

2. 材料

      ( 1 ) 大腸桿菌菌株 C600  和衍生菌株 C600p。用于轉化的菌株。

      ( 2 ) Luria-Bartani 培養基（每升含：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 g 氯化鈉和 1.5% 菌用瓊脂糖用于培養板）和基本培養基 M9 ( 5X 原液，每升含：30 g 磷酸氫二鈉、15 g 磷酸二氫鉀、5 g 氯化銨、2.5 g 氯化鈉和 1.5% 菌用瓊脂糖用于培養板），補充以  20 μg/ml 氨基酸（見(jiàn)注 1 ) 和 0.0005% 硫胺。富培養基和基本培養基都如標示的那樣補充以抗生素：50 μg/ml 氨芐青霉素（Ap) 或卡那霉素（Kn)。

      ( 3 ) 色氨酸類(lèi)似物：4-、5- 和  6- 氟色氨酸（ fW )，Sigma ( St. Louis，MO)。

      ( 4 ) 質(zhì)粒：用于蛋白質(zhì)高表達。用于基因的聚合酶鏈反應（PCR ) 擴增或另外來(lái)源的編碼 GFPuv 基因和質(zhì)粒來(lái)源的 Kn 激酶基因。

      ( 5 ) Vent 和 Tag DNA 聚合酶，限制性?xún)惹泻怂崦?，DNA 酶，T4 激酶和 T4 DNA 連接酶。

      ( 6 ) 寡核苷酸引物和 dNTP. （Invitrogen)。

      ( 7 ) 細菌蛋白抽提物試劑（B-PER ) 和 B-PER II  ( Pierce，Beverly，MA) 。

      ( 8 ) 100 mmol 溶于水的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG ) 作為儲備液。

      ( 9 ) Microcon 濃縮器，攔截的相對分子質(zhì)量為 10000。

      ( 10 ) 谷胱甘肽-瓊脂糖糖球珠（Amersham  Biosciences， Piscataway， NJ)。

      ( 11 ) Ni-次氮基三乙酸（NTA ) 樹(shù)脂（Novagen) 和蛋白質(zhì)純化柱（Bio- Rad，Hercules，CA )。

      ( 12 ) Centri-Sep 尺寸排斥柱（Princeton  Separation， Adelphia，NJ)。

      ( 13 ) L-甲苯磺酰氨-2-苯乙基氯甲基酮處理過(guò)的胰蛋白酶（Pierce，Beverly，MA)。

      ( 14 ) 磷酸緩沖液（PBS)：10X 儲備液，每升含：80 g 氯化鈉、2 g 氯化鉀、11.5 g 磷酸氫二鈉水合物（ Na2HPO4·7H2O ) 和 2 g 磷酸二氫鉀。

      ( 15 ) 1 mol/L 氯化鎂。

      ( 16 ) 50 mmol/L Tris-氯化氫，pH 8.0 和 5 mmol/L 還原谷胱甘肽。

      ( 17 ) Ni-NTA 純化用的緩沖液：

      a. 結合緩沖液，8X 儲備液：160 mmol/L Tris-氯化氫，pH 7.9，4 mol/L 氯化鈉和 40 mmol/L 咪唑。

      b. 清洗緩沖液，8X 儲備液：160 mmol/L Tris-氯化氫，pH 7.9，4 mol/L 氯化鈉和 480 mmol/L 咪唑。

      c. 洗脫緩沖液，8X 儲備液：160 mmol/L Tris-氯化氫，pH 7.9，4 mol/L 氯化鈉和 2 mol/L 咪唑。

      ( 18 ) 高效液相層析（HPLC) 分析用的緩沖液：

      a. 緩沖液 A：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0。

      b. 緩沖液 B：50 mmol/L NH4OAc，pH 5.0 和 50% MeOH。

     c. 緩沖液 C：0.1 mol/L 磷酸二氫鈉，pH 2.5。

      d. 緩沖液 D：0.1 mol/L 磷酸二氫鈉，pH 2.5 和 50% MeOH。

      ( 19 ) 瓊脂糖 DNA 凝膠設備和十二烷基硫酸鈉（SDS) 凝膠電泳（PAGE ) 設備。

      ( 20 ) HPLC、HPLC-電噴電離（ESI ) 和質(zhì)譜設備。

      ( 21 ) 微板閱讀器。

4. 注

      1. 光學(xué)純（對應體純）的非天然氨基酸可能不易購得。如果是消旋混合物，應使用 20 μg/ml L-對應體。如果非天然氨基酸是消旋混合物且要與天然氨基酸混合的話(huà)，應加倍非天然氨基酸的用量。例如，95% 4fW 需要 38 μg/ml DL-4fW 加 1 μg/ml L-W。

      2. 為了摻入非天然氨基酸，優(yōu)先使用營(yíng)養缺陷型菌株，但并不是對所有應用都是必需的。為了選擇展現基因編 碼模糊的菌株，Doring 等使用了對纈氨酸和半胱氨酸是原養型的菌株，并選擇在纈氨酸編碼處可能用半胱氨酸代替纈氨酸的變種；結果是一個(gè)編碼缺陷的異戊氨酰轉移 RNA 合成酶 [19] 。

      3. 此處討論的是典型表達質(zhì)粒的載體。一個(gè)是使用 T7 RNA 聚合酶系統并在 lac 操縱子的控制之下；而另一個(gè)是為了表達目標基因則直接使用 lac 啟動(dòng)子。許多其他的表達載體已被用于把非天然氨基酸摻入感興趣的蛋白質(zhì)中，并用于完整的、部分的和定點(diǎn)的類(lèi)似物摻入[ 1，5，19] 。

      4. 為了達到最大的表達和感興趣的基因的摻入可能需要優(yōu)化。優(yōu)化的關(guān)鍵因素包括接種和轉移到含引導物和非天然氨基酸的培養基之間的時(shí)機，以及表達延續時(shí)間的長(cháng)短。例如，發(fā)現中指數期的培養液過(guò)夜表達的 GST 達到極大，而從中指數期再延續幾小時(shí)的表達對 GFPuv 是最好的。更引人注目的是，用于熒光試劑的強藍綠熒光蛋白的表達，包括熒光激活細胞分選，誘導過(guò)夜培養液再表達 6 h 的蛋白質(zhì)最好。

      5. 在這些例子中，用 HPLC 對水解蛋白的分析，通過(guò)檢查產(chǎn)物中的天然的吸收光色氨酸得到簡(jiǎn)化。如果對其他氨基酸類(lèi)似物完成類(lèi)似的實(shí)驗，氨基酸在 HPLC 分析之前可能需要衍生化。

      6. 在 0.45 μm 孔徑的 Millipore 旋轉柱中完成實(shí)驗，對胰蛋白酶處理更有效（M .P. Robertson，私人通信，2003 年 5 月 12 日）。在反應的最后時(shí)間，胰蛋白酶可以用離心來(lái)純化。固定化的胰蛋白酶吸附在膜中，洗脫液攜帶反應產(chǎn)物。

參考文獻

1.  W a n g ,  L.  ,  Z h a n g ,  Z.  ,  B r o c k ,  A .  ,  an d   S c  h u ltz ,  P.  G.  ( 2 0 0 3 )   A d d itio n   o f  th e   k e to   f u n  ctio n al   g r o u p   to   th e   g en eticcode  o f  Escherichia coli.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA  1 0 0 ,  56-61 .

2.  B u d isa,  N .  ,  S te ip e ,  B.  ,  D em an g e,  P .  ,  E c k e  r s k o r n ,  C.  ,  K e lle r m a n n ,  J.  ,  an d   H u b e r ,  R.   ( 1 9 9 5 )   H ig h -lev el  b ios y n th e tic   s u b s titu tio n   o f  m eth io n in e  in   p r o  tein s   b y   its   an alo g s   2 -am in o h ex an o ic   acid ,  se len  o m eth io n in e ,  te llu ro m e -th io n in e   an d   eth io n - in e    in   Escherichia coli. Eur. J . Biochem.  230 >   788-796.

3.  B a ch er,  J.  M .  ,  H u g h e s ,  R.  A .  ,  T ze-F ei  W o n g  ,  J.  ,  an d   E llin g to n ,  A .  D.  ( 2 0 0 4 )   E v o lv in g   n  ew   g en eticcodes.  Trends Epol. Evol.  1 9 ， 69-75.

4.  B a c h e r,  J.  M.  ,  B u ll,  J.  J .   ,  a n d   E llin g to n ,   A .  D.  ( 2 0 0 3 )   E v o lu tio n   of  p h ag e   w ith   ch em  ically   am b ig u o u s   p r o -teo m es.   BMC Evolutionary Biol.  3 ,   24.

5.  Bacher,  J.  M.  and   E llin g to n ,  A.  D.  (2 0 0 1 )   Selection   and   characterization   of  Escherichia coli  variants  capable  of  g  ro w th   onan   otherw ise  toxic   try p to p h an   analogue.  J.  BacterioL  1 8 3 ,  5414-5425.

6.  W o n g ,  J .   T .  ( 1 9 8 3 )   M e m b e rs h ip  m u ta tio n    o f  th e   g en etic   co d e ：   lo ss   o f  f itn e ss   b y   tr y p  to p h a n .   Proc,Natl. Acad. Sci. USA  8 0 ,  6303 -6 3 0 6 .

7.  B r o n sk ill,  P .  M.  an d   W o n g ,  J.  T .  ( 1 9 8 8 )   S u  p p re ss io n   o f  flu o rescen ce   o f  tr y p to p h a n   resid u  es   in   p r o te in s   b y   r ep lacem en t  w ith   4 - f lu o r o tr y p to p h a n .  Biochem, J .  2 4 9 ,   305-308.

8.  P arso n s,  J.  F.  ,  X iao,  G.  ,  Gilliland,  G.  L.  ,  and   A  rm stro n g ,  R   N.  ( 1 9 9 8 )   Enzymes  harboring  u n n atu ral   amino  acid s： m echanistic  and   stru ctu ral  analysis  of  th e    enhanced  catalytic  activity   of  a   glu tath io n e  tran sferase    containing  5_fluorotrypto_phan.  Biochemistry  3 7 ,  6286-6294.

9.  P r a tt,   E.  A .  an d   H o ,  C.  ( 1 9 7 5 )   In co rp o r atio  n   o f   f lu o r o tr y p to p h a n s   in to   p r o te in s   o f   Escherichia coli. Biochemistry 1 4 ,  3 0 35-3040.

10.  Z h a n g ,  Q.  S.  ,  S h e n ,  L.  ,  W a n g ,  E.  D.  ,  an d    W a n g ,  Y .  L.  ( 1 9 9 9 )   B io s y n th esis  an d   ch ar acter  izatio n   o f  4 -flu o r o try p to p h a n -la b e le d   Escherichia  coli  a r g in y l-tR N A   s y n th e ta s e .   J . Protein Chem.  1 8 ,  1 87-1 92.

11.  B r o w n e,  D.  R.  ,  K e n y o n ,  G.  L.  ,  an d   H e g e m a  n ,  G.  D.  ( 1 9 7 0 )   I n c o r p o r a tio n   o f  m o n o f lu r o  tr y p to p h a n s  in to   p r ote in   d u r in g   th e   g r o w th   of  Escherichia coli. Biochem.  Biophys. Res. Commun.  3 9 , 1 3-19.

12.  G u a n ,  K.  L.  an d   D ix o n ,  J.  E.  ( 1 9 9 1 )   E u k a  ry o tic   p r o te in s   e x p r e ss e d   in   Escherichia  coli：   a  n   im p ro v ed   th r o m b incleav ag e   an d   p u rificatio n   p ro  ced u re   o f  fu sio n   p r o te in s   w ith   g lu ta th io n e   S  -tr a n s fe r a s e .  Anal, Biochem.  1 9 2 ,262-267.

13.  X u ,  Z.  J.  ,  L o v e,  M .  L.  ,  M a ,  L.  Y.  ,  e t   al.   ( 1 9 8 9 )   T r y p to p h a n y l- tR N A   s y n th e ta s e   fro m    Bacillus  subtilis.  C h a racter izatio n   an d   ro le   of  h y d r o  p h o b icity   in   s u b s tr a te   reco g n itio n .  J . Biol. Chem.   2 6 4 ,  430 4 -4 3 1 1 .

14.  H e n d r ic k s o n ,  T .  L.  ,  N o m a n b h o y ,  T .  K.  ,   de  C r ecy - L a g ard ,  V.  ,  e t   al.  ( 2 0 0 2 )   M u ta tio n a  l  s e p a ra tio n   o f  tw op a th w a y s   f o r   ed itin g   b y    a   class  I   tR N A   s y n th e ta s e .   Mol. Cell.  9 ,  35 3 -3 6 2  .

15.  B a c h e r,  J.  M .  ,  d e   C r e c y - L a g a rd ,  V .  ,  an  d   S ch im m el,  P .  ( 2 0 0 5 )   I n h ib ite d   cell  g r o w th    a n d   p r o te in   fu n ctio n alch an g es   f ro m   a n   ed itin g  -d efectiv e   tR N A   s y n th e ta s e .   Proc. Natl. Acad, Sci. USA   1 0 2 , 1 697-1 701 .

16.  K in g ,  P .  V .  an d   B lak e sly ,  R.  W.  ( 1 9 8 6 )   O p  tim izin g  D N A   lig atio n s   f o r   tr a n s f o rm a tio n s .    Focus  8?  30-32.

17.  M in k s， C . ， A le f e ld e r， S . ， M o r o d e r， L . ， H u  b e r ， R . ， an d   B u d is a ， N .  ( 2 0 0 0 )   T o w a r d s   n  e w   p r o te in   en g in eerin g ：   in vivo   b u ild in g   an d   fo ld in g   o f  p r o te in    s h u ttle s   fo r   d ru g   d eliv ery   an d   ta r g e tin g   b y    th e   selectiv e   p r e s s u r e   in co rpo r a tio n   ( S P I )   m eth o d .  Tetrahedron  5 6 ,  9431 -9442.

18.  A u s u b e l,  F.  M .  ( 1 9 8 7 )   C u r r e n t  p ro to co ls    in   m o lecu lar  b iology.  G reen e  P u b .  A s so ciates  an d   W  ile y - In te r sc ie n c e ,N ew   Y o rk .

19.  D o r in g ,  V .  ,  M o o tz ,  H .  D.  ,  N a n g le ,  L.  A .   ,  et  al.  ( 2 0 0 1 )   E n la rg in g   th e   am in o   acid   se t  o  f  Escherichia coli  b y   in f iltr a tio n   o f  th e   v alin e   co d in g   p ath w ay .  Science   2 9 2 ,  501 -504.

20.  W a n g ,  L.  ,  B r o ck ,  A.  ,  H e r b e r ic h ,  B.  ,  an d    S c h u ltz ,  P.  G.  ( 2 0 0 1 )   E x p an d in g   th e   g en etic    code   o f   Escherichia coli.  Science  2 9 2 ,  4 9 8 -5 0 0