設計策略

      PS：該方法適用于檢測或部分 DNA 片段克隆，不適合全長(cháng)基因克隆

      反轉錄 PCR 的主要問(wèn)題是基因組 DNA (gDNA) 污染的存在，這將導致產(chǎn)生假陽(yáng)性信號，特異性降低或對特定 RNA 的過(guò)高估計。為了消除 RT-PCR 中 gDNA 的干擾，可將引物設計為與兩個(gè)外顯子的接合部退火，該點(diǎn)為 cDNA 序列專(zhuān)有，因此 gDNA 將不能被擴增。

      cDNA 特異的引物可通過(guò)三個(gè)途徑設計（如下圖所示）。

cDNA、gDNA選擇性引物設計原理圖

      1. 引物橫跨外顯子-外顯子接合部。設計的引物如果一半與一個(gè)外顯子的 3'端結合，而 另一半與相鄰外顯子的 5'端結合，它將只與 mRNA 或由已剪切的 mRNA 合成的 cDNA 退 火，而不與 gDNA 結合，因而可以避免對 gDNA 污染的擴增。正向或反向引物都可設計為 橫跨外顯子接合部；而另一個(gè)引物可設計為結合于另一個(gè)外顯子接合部或在完全位于外顯子 內部的位點(diǎn)上。

      2. 外顯子完全配對-內含子交叉配對引物。為了從 cDNA 和 gDNA 混合物中選擇性地擴增 gDNA, 設計的引物應與外顯子-內含子接合部退火，這種引物叫做外顯子完全配對-內含子交叉配對（exon-primed intron-crossing，EPIC) 引物（Bierneetal. 2000)。EPIC 引物可 在系統發(fā)育研究中用于擴增同源的內含子區域，因為外顯子序列相對內含子而言更保守。

      3. 引物位于外顯子-外顯子接合部的側面。設計的 RT-PCR 引物位于至少含一個(gè)內含子 的區域的側面。這樣以 cDNA 為模板擴增的片段要小于以 gDNA 為模板擴增的片段，這種 大小的差異可以幫助檢測 gDNA 污染的存在。

    （本文轉載丁香園）