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RT-PCR的注意事項

 
一、防止RNA酶污染的措施
      1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(cháng)時(shí)間。
      2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
      3. 有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室溫10min,然后用0.1% DEPC水沖洗,晾干。
      4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
      5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實(shí)驗過(guò)程中手套要勤換。
      6. 設置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗室,所有器械等應為專(zhuān)用。

二、常用的RNA酶抑制劑
      1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
      2. 異硫氰酸胍:目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來(lái),又對RNA酶有強烈的變性作用。
      3. 氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
      4. RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasinRNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。
      5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,因此在分離和純化RNA過(guò)程中不能使用,而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容。
 
      在所有RNA實(shí)驗中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(cháng)的RNA。而實(shí)驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。

 
      研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實(shí)驗時(shí)應勤換手套。DEPC能與胺和巰基反應,因而含TrisDTT的試劑不能用DEPC處理。

三、動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法
  Trizol法適用于人類(lèi)、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養細菌,樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析,斑點(diǎn)雜交, Poly(A) 分離,體外翻譯,RNase封阻分析和分子克隆。
  1、將組織在液N中磨成粉末后,再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨,注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。
  2、研磨液室溫放置5分鐘,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒。
  3、取上層水相于一新的離心管,按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘。
  4、棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,渦旋混勻,4℃7500g離心5分鐘。
  5、小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10分鐘,注意不要干燥過(guò)分,否則會(huì )降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。

[注意]
      1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。另外,提取上清這步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然會(huì )有蛋白質(zhì)污染,影響比值。
  
      2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。

(本文轉載丁香園
 
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