真核生物中，從個(gè)體的生長(cháng)、發(fā)育、衰老、死亡，到組織的得化、調亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質(zhì)上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30000個(gè)不同的基因，但在生物體內任意8細胞中只有10%的基因的以表達，而這些基因的表達按特定的時(shí)間和空間順序有序地進(jìn)行著(zhù)，這種表達的方式即為基因的差異表達。其包括新出現的基因的表達與表達量有差異的基因的表達。生物體表現出的各種特性，主要是由于基因的差異表達引起的。

      由于基因的差異表達的變化是調控細胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機制，通過(guò)比較同一類(lèi)細胞在不同生理條件下或在不同生長(cháng)發(fā)育階段的基因表達差異，可為分析生命活動(dòng)過(guò)程提供重要信息。研究基因差異表達的主要技術(shù)有差別雜交（differential hybridization）、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差異顯示（mRNA differential display， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差異分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差別顯示技術(shù)（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表達系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。

一、差別雜交與扣除雜交

      差別雜交（differential hybridization）又叫差別篩選（differential screening），適用于分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的mRNA的cDNA克隆。為了增加這種方法的有效性，后來(lái)又發(fā)展出了扣除雜交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克?。╯ubtractive cDNA cloning），它是通過(guò)構建扣除文庫（subtractive library）得以實(shí)現的。

     （一）差別雜交

      從本質(zhì)上講，差別雜交也是屬于核酸雜交的范疇。它特別適用于分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長(cháng)因子調節的基因、以及在特定發(fā)育階段表達的或是參與發(fā)育調節的基因，同時(shí)亦可有效地用來(lái)分離經(jīng)特殊處理而被誘發(fā)表達的基因。目前，差別雜交篩選法在克隆基因的分離工作中有著(zhù)相當廣泛的用途。

      差別雜交的技術(shù)基礎十分簡(jiǎn)單，它不需要任何有關(guān)的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍擁有兩種不同的細胞群體：在一個(gè)細胞群體中目的基因正常表達，在另一個(gè)細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可制備到兩種不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA類(lèi)型的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA類(lèi)型的總mRNA群體。因此，可以通過(guò)這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進(jìn)行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時(shí)，所有包含著(zhù)重組體的菌落都呈陽(yáng)性反應，在X光底片上呈現黑色斑點(diǎn)，而使用不存在目的基因的mRNA探針時(shí)，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽(yáng)性反應，在X光底片上呈現黑色斑點(diǎn)。比較這兩種底片并對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進(jìn)一步研究使用。

      差別雜交篩選技術(shù)已被成功地用于分析爪蟾和粘菌的發(fā)育問(wèn)題。這兩個(gè)應用例子表明，處于不同發(fā)育狀態(tài)或階段的豐度相差5倍的特異的mRNA種是能夠被檢測出來(lái)的。生長(cháng)因子調節基因（growth factor-regulated gene）的克隆，是差別雜交成功應用的一個(gè)典型例子。我們知道，血清中含有生長(cháng)因子，因此用血清處理處于靜止期的細胞時(shí)，便會(huì )迅速誘發(fā)生長(cháng)因子調節基因進(jìn)行表達。所以，分別從靜止期細胞培養物和經(jīng)血清激活3小時(shí)的細胞培養物中提取的poly(A)mRNA制劑，在mRNA種類(lèi)上是有差別的，至少后者比前者多出了一種生長(cháng)因子調節基因的mRNA類(lèi)型。用從激活細胞中分離的poly(A)mRNA反轉錄合成的cDNA與λ噬菌體載體重組，構成cDNA文庫，并同時(shí)復制兩份硝酸纖維素濾膜。A組濾膜同血清激活細胞制備的cDNA探針雜交，B組濾膜同靜止期細胞制備的cDNA探針雜交。將所得的放射自顯影圖片進(jìn)行仔細的比較，從中鑒定出只同激活細胞探針雜交而不能同靜止期細胞探針雜交的噬菌斑位置。這些克隆便有可能是帶有受血清誘發(fā)表達的生長(cháng)因子調節基因的DNA編碼序列。

     （二）扣除雜交

      差別雜交可有效地對于因特殊處理而被誘發(fā)產(chǎn)生的mRNA的cDNA克隆的分離，或是在細胞中具高表達效率的mRNA之cDNA克隆的分離，但對于低豐度的mRNA的cDNA克隆的分離則有相當的困難。為了進(jìn)一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實(shí)可行的辦法是應用扣除雜交篩選法構建富含目的基因序列的cDNA文庫。

      扣除雜交法的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使待分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。下面以T細胞受體（T-cell receptor，TCR有時(shí)亦稱(chēng)之為T(mén)細胞抗原受體）編碼基因的分離為例子，說(shuō)明扣除雜交篩選法的基本原理與簡(jiǎn)要過(guò)程。T細胞和B細胞來(lái)自共同的前體細胞，兩者都能夠識別特異的抗原。但與B細胞不同，T細胞不能識別游離的抗原，而只能識別在其它細胞表面的抗原。T細胞的這種抗原識別特異性是由TCR基因決定的。TCR基因只能在T細胞中表達，而不能在B細胞中表達。那么從T細胞mRNA制備來(lái)的單鏈cDNA，同大大超量的B細胞的mRNA在有利于發(fā)生DNA-RNA雜交的條件下保溫，其結果會(huì )是所有的能夠在T和B兩類(lèi)細胞中同時(shí)表達的T細胞基因的cDNA分子（約占98％），都能與B細胞的mRNA退火形成DNA-RNA雜交分子，而不能在B細胞中表達的、T細胞特有的cDNA（約占2％），由于B細胞中沒(méi)有相應的mRNA，故不能形成DNA-RNA雜交分子，仍然處于單鏈的狀態(tài)。將此種雜交混合物通過(guò)羥基磷灰石柱（hydroxylapatite column），于是DNA-RNA雜交分子便結合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過(guò)柱流出?；厥盏降腡細胞特異的cDNA被轉變?yōu)殡p鏈cDNA之后，與適當的λ噬菌體載體重組并轉染給大腸桿菌寄主細胞，這樣便得到了T細胞特異cDNA高度富集的扣除文庫。然后再按照同樣方法制備扣除的cDNA探針，即被B細胞mRNA雜交扣除了的T細胞特異的cDNA探針，篩選文庫，可成功地分離到了T細的TCR基因。

      扣除雜交法同樣也可以用來(lái)分離缺失突變基因。從野生型植株制備的染色體總DNA，用一種適當的核酸內切限制酶（比如Sau3A）切割成小片段。同時(shí)從缺失突變體植株制備的染色體總DNA，經(jīng)隨機切割之后，用生物素（biotin）進(jìn)行標記，作為非同位素標記探針使用。取大大超量的此種探針，同Sau3A酶切的野生型染色體總DNA片段混合，經(jīng)變性、退火處理，溶液中的無(wú)生物素標記的野生型的DNA分子便同生物素標記的突變型的DNA探針雜交。將雜交反應混合物通過(guò)生物素結合蛋白質(zhì)柱（avidin column）。這種柱是用包裹著(zhù)生物素結合蛋白質(zhì)的專(zhuān)用的細小磁珠裝填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突變型植株的生物素標記的DNA探針雜交，便被結合到柱上。而野生型植株的DNA片段由于在突變型DNA中缺失了相應的片段，故沒(méi)有相應的生物素標記的探針與之雜交，經(jīng)洗脫便過(guò)柱流出。隨后將洗脫收集的DNA同超量的生物素標記探針再雜交，再過(guò)柱。如此經(jīng)過(guò)多次重復富集之后，用PCR法擴增DNA片段，并予以克隆。最后用Southern雜交法進(jìn)一步鑒定出，只同野生型DNA雜交而不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽(yáng)性克隆。

 （本文轉載丁香園）