各種微生物在代謝類(lèi)型上有時(shí)會(huì )表現出很大的差異。由于細菌特有的單細胞原核生物特性，這種差異就表現得更加明顯。不同細菌具有不同的酶系統，故不同細菌分解、利用糖類(lèi)、脂肪類(lèi)和蛋白類(lèi)物質(zhì)的能力表現不同，它們對物質(zhì)的代謝譜和分解產(chǎn)物也就不同，利用這種特點(diǎn)建立細菌生化反應，在菌株的分類(lèi)鑒定中具有主要意義。

【實(shí)驗目的】

     1. 了解細菌鑒定中常用的生理生化試驗反應原理。

     2. 掌握測定細菌生理生化反應的技術(shù)和方法。

【實(shí)驗原理】

     各種細菌由于具有不同的酶系統，致使它們能利用不同的底物，或雖然可以利用相同的底物，卻產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物，因此可以利用各種生理生化反應來(lái)鑒別細菌。

【試劑與器材】

     1. 菌種　大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的斜面菌種

     2. 培養基　葡萄糖蛋白胨水培養基、蛋白胨水培養基、糖發(fā)酵培養基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）

     3. 試劑　百分之四十NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、溴甲百分之一點(diǎn)六基酚紫指示劑。

     4. 器具　超凈工作臺、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。

     5. 流程　糖發(fā)酵試驗→V-P試驗→甲基紅試驗→吲哚試驗。

【實(shí)驗方法與步驟】

     1. 糖發(fā)酵實(shí)驗

     ① 試管標記　取分別裝有不同糖類(lèi)（如葡萄糖、蔗糖和乳糖等）發(fā)酵培養液的試管，根據需要培養的細菌做好標記（如大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌等和空白對照）。

     ② 接種培養　以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應試管中，空白對照中不接種，置37℃恒溫箱中培養，分別在培養24h、48h和72h觀(guān)察結果。

     ③ 觀(guān)察記錄　培養后各發(fā)酵管與空白對照相比，若接種培養液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培養液呈黃色，反應結果為陽(yáng)性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培養液中的杜氏小管內有氣泡為陽(yáng)性反應，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內沒(méi)有氣泡為陰性反應，記錄用“－”表示。

     2. V.P.試驗

     ① 標記試管　取裝有葡萄糖蛋白胨培養液的試管，根據需要將培養的細菌做好標記。

     ② 接種培養　以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接種，置37℃恒溫箱中，培養24～48h。

     ③ 觀(guān)察記錄　取出以上試管，振蕩2min。另取5支空試管相應標記菌名，分別加入3～5ml以上對應管中的培養液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并加入約0.5～1mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min后，若培養液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽(yáng)性反應（用“＋”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應（用“－”表示）。

     注：原試管中留下的培養液用作甲基紅試驗。

     3. 甲基紅試驗（M.R.試驗）

     取裝有葡萄糖蛋白胨水培養液的試管，接種需培養鑒定的細菌，經(jīng)過(guò)夜培養后，加入2～3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細觀(guān)察培養液上層，若培養液上層變成紅色，即為陽(yáng)性反應；若仍呈黃色，則為陰性反應，分別用“＋”或“－”表示。

     4. 吲哚試驗

     ① 試管標記   取裝有蛋白胨水培養液的試管，根據需要培養的細菌做好標記。

     ② 接種培養   以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，第5管作空白對照不接種，置37℃恒溫箱中培養24～48h。

     ③ 觀(guān)察記錄   在培養液中加入5～10滴吲哚試劑，使試劑浮于培養物表面，形成兩層，觀(guān)察結果：如有吲哚存在，乙醚層呈現玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽(yáng)性反應，否則為陰性反應，陽(yáng)性用“＋”、陰性用“－”表示