一、技術(shù)背景：

     Adeasy 系統利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優(yōu)點(diǎn)，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、高效的病毒載體。利用帶有E1 基因的293 細胞作為包裝細胞，通過(guò)倍比擴增，富集病毒顆粒，并通過(guò)CsCl 梯度離心，透析進(jìn)行分離純化。對絕大多數的細胞株可以達到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉染試劑都不可避免的細胞毒性問(wèn)題。

二、所需試劑：

     1. 293 細胞；

     2. 重組好的腺病毒質(zhì)粒；

     3. Pac I 限制性?xún)惹忻福?/span>

     4. 質(zhì)?；厥障嚓P(guān)試劑；

     5. 細胞培養、轉染相關(guān)試劑；

     6. TBS：10mM Tris, 0.9% NaCl，pH8.1；

     7. 40% CsCl：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；

     8. 15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；

     9. Beckman 離心管：14*89 mm，SW41 轉頭；

     10. Polybrene (sigma)，10 mg/ml；

     11. 透析袋：Spectrum Co. （成卷供應，帶少量甘油，硫化物與重金屬） MW=8000~14400；

     12. 滅菌甘油。

三、操作流程：

     1. 293 細胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在轉染前24 小時(shí)接種于1 或2 個(gè)60 mm 培養盤(pán)中，使之在轉染時(shí)細胞匯合率為50-70%；

     2. 在轉染前，用Pac I 處理目的質(zhì)粒（一般一個(gè)60 mm 細胞盤(pán)需要6μg DNA）。處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20 μl 無(wú)菌水中；

     3. 用PEI 或其他轉染試劑將6 μg Pac I 處理過(guò)的質(zhì)粒轉染細胞；

     4. 8 個(gè)小時(shí)后移去混合液，加入4 ml DMEM 完全培養液（10% CBS，1%Pen/Strep）；

     5. 在轉染后7 到10 天用細胞刮（而不是胰酶）將細胞從瓶中刮下并移入50ml錐形管。離心后將細胞重懸于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中凍結細胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行4 次。注意保存時(shí)不要反復凍融，可保存于-20℃；

     6. 將293 細胞以50-70%的匯合率鋪于60 mm 培養盤(pán)中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明顯的細胞裂解或CPE 現象；

     7. 在有1/3 到1/2 的細胞脫離漂浮時(shí)，通常是感染后3-5 天收集病毒?？蛇M(jìn)一步通過(guò)Western blot 或PCR（5 μl 病毒上清加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1 小時(shí)，然后煮沸樣品5 min，離心后取1-2 μl 進(jìn)行PCR 反應）證實(shí)重組腺病毒的存在；

     8. 按步驟5 的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107 infectiousparticles/ml 的病毒。每輪的擴增應能提高一個(gè)數量級的梯度；

     9. 為了進(jìn)一步擴增，將步驟8 獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100 mm 培養盤(pán)的細胞，按步驟5 的方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染150 mm 細胞培養盤(pán)中的293細胞，以獲得足夠量的病毒；

     10. 將15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 離心管中制備CsCl 梯度溶液；

     11. 將最終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上；

     12. 超速離心，30000 rpm，4 度離心16 個(gè)小時(shí)；

     13. 離心后，應有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16 號針頭將這一條帶收集；

     14. 在TBS 中透析一小時(shí)，隨后在含有10％甘油的TBS 中透析兩次，每次一小時(shí)；

     15. 將純化的腺病毒分裝于EP 管中；

     16. 在Eppendorf Biophotometer 中測量透析液中的總蛋白量，1μg 病毒蛋白相當于4×109病毒顆粒；

     17. 長(cháng)期保存于-70 度中，短期可保存于4 度，切忌反復凍溶；

     18. 由于腺病毒對不同細胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細胞毒副作用，通常通過(guò)梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細胞數1：1，10：1，100：1，1000：1 的病毒顆粒感染靶細胞；加入相對培養液體積1：1000 的Polybrene。在37 度下平板離心30 分鐘；

     19. 感染8~12 小時(shí)后換液。將含有病毒的培養液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液。