最近在做原核表達，包涵體。以前也做過(guò)，但經(jīng)驗不多。有那么一點(diǎn)失敗的教訓以及純化過(guò)程中的體會(huì )，現在寫(xiě)出來(lái)與大家共享，同時(shí)希望得到同行們的指正。

     1. 首先介紹一下背景。載體是pET22b，Amp抗性。菌株是BL21 star DE3，是一個(gè)蛋白降解酶突變菌株，也就是說(shuō)是一種優(yōu)化表達菌株。

     2.第一次失敗。第一次做誘導的時(shí)候，重復了很多次，但總是誘導不出來(lái)。PCR，酶切都正確。但沒(méi)等測序結果出來(lái)就開(kāi)始做了，失敗了。曾在網(wǎng)上求助。后來(lái)證明是引物錯誤。我們實(shí)驗室合成引物都要先發(fā)給一個(gè)機構，然后才由他們與公司交涉。這個(gè)office的老太太把引物弄掉了一個(gè)堿基。

     教訓： 在實(shí)驗過(guò)程中，再仔細都是不為過(guò)的。引物來(lái)了后管壁上貼有序列，但我忽略了。

     3. 第二次失敗。后來(lái)重新構建，轉化，誘導。第一次誘導時(shí)根本就沒(méi)帶。然后開(kāi)始找悶頭原因。周一下午5點(diǎn)我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看醫生了，等了很久，到第二天中午11點(diǎn)才轉接！而且是按1:50轉接的！也就是菌在轉接之前培養了18小時(shí)！

     我們都知道，帶Amp的E.coli在含Amp的平板上培養超過(guò)16 小時(shí)后，菌周?chē)鷷?huì )長(cháng)出小菌落，我們叫它衛星菌落。這是因為細菌在生長(cháng)的時(shí)候，為了抵抗Amp，會(huì )分泌B－內酰胺酶，而該酶會(huì )降解培養基中的Amp。對Amp產(chǎn)生抗性的機制和其他抗生素的情況是不同的（具體可以翻看分子克?。?。到菌體生長(cháng)到足夠濃度的時(shí)候，培養基的Amp就會(huì )慢慢減少。 一旦細菌失去選擇壓力，就可能造成質(zhì)粒丟失。當Amp降到很低，不足以抑制細菌生長(cháng)時(shí)，未攜帶質(zhì)粒的菌就會(huì )長(cháng)得比帶質(zhì)粒的快。所以當培養時(shí)間足夠長(cháng)后，培養基中的B－內酰胺酶就會(huì )積累到很高的濃度。轉接時(shí)（我是1:50轉的），高濃度的酶可能破壞新鮮培養基中的Amp（而且我用的濃度是50 ug/ml）。這樣，就造成最后收集的菌中，大部分都是沒(méi)有帶質(zhì)粒的菌了。

     當然還有一個(gè)可能的原因就是死亡的菌體分泌一些降解酶，使得表達檢測失敗。

     這兩種推測都只是推測，但我覺(jué)得第一種情況應該引起我們的重視。在使用Amp抗性的時(shí)候要格外注意。