1980年代之前，細菌的分類(lèi)和鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)特征、培養特征、生理生化特征和免疫學(xué)反應進(jìn)行。這些方法在細菌分類(lèi)鑒定中發(fā)揮過(guò)重要作用，也存在著(zhù)鑒定準確性差、繁瑣耗時(shí)等缺點(diǎn)。隨著(zhù)分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，特別是聚合酶鏈式反應技術(shù)(PCR)的發(fā)明，細菌的分類(lèi)鑒定發(fā)生了重大革新，開(kāi)始進(jìn)入分子水平，一批分子鑒定方法也隨之產(chǎn)生。其中16S rDNA基因的同源性分析已經(jīng)成為細菌種屬鑒定的標準方法，在細菌的分類(lèi)研究中起著(zhù)重要的作用。

     16S rDNA基因存在于原核生物中。它由保守區和可變區組成，保守區為所有細菌所共有，細菌間沒(méi)有差別；可變區在不同細菌之間存在不同程度的差異，具有屬或種的特異性。細菌的16S rDNA序列長(cháng)約1.6kb左右，其序列變化速度與進(jìn)化速率相適應，因此被廣泛用于種屬鑒定。結合完善的數據庫，16S rDNA序列分析可以快速準確的對微生物進(jìn)行種屬鑒定，確定微生物在進(jìn)化中的位置。根據16SrDNA序列同源性分析建立細菌系統發(fā)育分類(lèi)的準確性和重要性已經(jīng)被越來(lái)越多的細菌分類(lèi)學(xué)者所認識和接受。

     擴增細菌的16S rDNA基因需要其染色體DNA作為模板。目前較常用的細菌染色體DNA 的小量制備方法是SDS堿裂解法和煮沸法，前者需多步酚抽提去除蛋白質(zhì)，提取過(guò)程需要8h左右；而后者僅適用于少數種屬的細菌。本文建立了1種新的從細菌中快速簡(jiǎn)便的批量提取染色體DNA 的方法，整個(gè)提取過(guò)程僅需20min。用該方法制備的染色體DNA無(wú)需任何處理即可作為模板用于PCR擴增細菌的16S rDNA序列。

一、材料與方法

     1. 測試菌株

     供研究的22株細菌分離物為本中心前期分離于云南等地土樣并保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心，編號為C1～C22。

     2. 培養基

     肉汁培養基、MRS培養基和高溫菌培養基。

     3. 測試菌株的培養

     將C1～C22號測試菌株從甘油保藏管中接出，并在相應平板上劃線(xiàn)。除高溫菌平板在70℃ 培養外，其余平板都在37℃培養。

     4. 細菌染色體DNA的快速提取

     取1.5 mL離心管，稱(chēng)重。在管中加入100 L緩沖液I，從平板上刮數環(huán)菌于其中，振蕩均勻，9 000r/min,3min。棄上清液，稱(chēng)重，計算出菌體質(zhì)量。按照每毫克菌體10 L的比例，在離心管中加入緩沖液Ⅱ，將菌體振蕩均勻，放置于75℃反應15min得到染色體DNA粗提液，直接用于后續PCR反應。

     5. PCR擴增及產(chǎn)物測序

二、結果與討論

     1. 細菌染色體DNA快速提取方法的建立

     研究試圖建立一種適合大批量樣本操作的細菌染色體DNA快速提取方法，并要求所建立方法制備的染色體DNA溶液不需經(jīng)過(guò)任何后期處理便可直接用于后續的PCR反應。為此，對細菌染色體DNA快速提取方法中的2個(gè)關(guān)鍵溶液(緩沖液I和緩沖液Ⅱ)的配制和組成及其廣泛應用性進(jìn)行了研究和分析。緩沖液I中含有2 mmol/L的EDTA(pH8.0)和0.01 的Tw-20。緩沖液II由2mol/L的NaOH溶液組成，并用非離子型濃度相關(guān)性pH緩沖劑小心調節緩沖液Ⅱ的pH至13.4。

     2. 提取的染色體DNA質(zhì)量分析

    （1）瓊脂糖凝膠電泳檢驗

     取細菌染色體DNA粗提液10ptL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，染色后凝膠成像。發(fā)現點(diǎn)樣孔內很亮，孔外有連續條帶存在。證明成功提取了22個(gè)測試菌株的染色體DNA。

    （2）PCR 產(chǎn)物檢驗