支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑0.2um)并獨立生活的微生物。約有1%可通過(guò)濾菌器。支原體無(wú)細胞壁形態(tài)呈高度多形性?？蔀閳A形、絲狀或梨形。

      支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀(guān)察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。

      支原體代謝需固醇類(lèi)物質(zhì)、部分種類(lèi)需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點(diǎn)。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7.6—8.0)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。

      支原體污染細胞后。培養液可不發(fā)生混濁。多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著(zhù)，細微變化也可由于傳代、換液而緩解。因此易被忽視。但個(gè)別嚴重者，可致細胞增殖緩慢。甚至從培養器皿脫落。

為確定有無(wú)支原體污染可做如下檢酗：

      ①相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養瓶?jì)鹊纳w玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀(guān)察。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。

      ②熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含有的DNA著(zhù)色，染色后用熒光顯微鏡觀(guān)察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長(cháng)滿(mǎn)前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀(guān)察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

      ③電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速。也可以利用透射電鏡。

      ④DNA分子條文檢查或支原體培養等方法：檢出率高。但方法較為復雜

      支原體是一類(lèi)缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著(zhù)色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長(cháng)，營(yíng)養要求比細菌高。

      細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。在細胞培養中支原體感染發(fā)生率達到63%，支原體感染發(fā)生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過(guò)可視法對其進(jìn)行檢測，而且它對細胞的生長(cháng)率影響較小，不易引起注意。國內外研究表明，95％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見(jiàn)的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類(lèi)是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。  

      支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實(shí)驗器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細胞的原始組織或器官的污染。

      組織細胞培養工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實(shí)驗操作；細胞培養基和器材要保證無(wú)菌；在細胞培養基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體最突出的結構特征是沒(méi)有細胞壁，一般來(lái)講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)及一些氟喹諾酮；其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開(kāi)發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過(guò)的培養細胞，不會(huì )重新感染支原體。

      紅霉素有效，而且不影響細胞生長(cháng)。網(wǎng)友“smilewf”經(jīng)驗是細胞剛開(kāi)始被支原體污染，細胞生長(cháng)極為緩慢，而且狀態(tài)不好，細胞之間及底部總有一些亮晶晶的顆粒狀物質(zhì)，換液后好些，但過(guò)2天又會(huì )增多，培養液清亮，嚴重時(shí)象一層細沙鋪在瓶底。剛開(kāi)始以為是消化過(guò)頭引起的細胞的碎片和細胞內的顆粒，后來(lái)發(fā)現與胰酶消化無(wú)關(guān)。使用紅霉素（就在醫院的門(mén)診購買(mǎi)，很便宜）后這種現象明顯好轉，背景干凈，細胞生長(cháng)很快，狀態(tài)明顯好轉，但好像紅霉素不能完全根治支原體感染，停藥后一段時(shí)間可以復發(fā)，但如果細胞很重要有沒(méi)有多余的細胞時(shí)可以考慮一試，我用后覺(jué)得效果不錯。 

      網(wǎng)友“zllxash”的經(jīng)驗：支原體是細胞培養中最常見(jiàn)的，干擾實(shí)驗結果的一種污染。但由于不易被察覺(jué)，有些污染的細胞仍在繼續使用。據查，目前各實(shí)驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。因此，對支原體污染應嚴加防范。

      用卡那霉素預防支原體污染有效。

檢測方法：

      1、相差顯微鏡檢測；

      2、低張處理地衣紅染色觀(guān)察； 

      3、DNA熒光染色法；

      4、電鏡檢測；

      5、3-H胸腺嘧啶摻入法； 

      6、聚合酶鏈反映法；

      7、免疫學(xué)方法； 

      8 、支原體的培養。

對于支原體污染的細胞，可以采取補救措施：

      1、抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時(shí)，再換入常規培養液，有時(shí)可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對于支原體污染抗生素應用，預防性應用比污染后使用好。

      2、 加溫除菌：根據支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。將受支原體污染的細胞置于41度中作用5-10小時(shí)可以殺滅支原體。但由于41度對培養細胞本身也有較大的影響，故處理前，應先進(jìn)行預試驗，確定出最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時(shí)間。

      支原體菌株來(lái)源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原體,M.FermentaneATCC19989發(fā)酵支原體 ,M.SalivariumATCC23064唾液支原體 ,M.HominisATCC23114人型支原體 ,M.OraleATCC23714口腔支原體 ,M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體。其共同引物序列來(lái)自16s和23s保守區域，外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；內部引物為 Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。 

      ＰＣＲ反應體系和條件：10×緩沖液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠)、ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、2.5ｍＭｄ ＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、Ｈ2Ｏ、石蠟油覆蓋。反應溫度和時(shí)間為:94℃/2ｍｉｎ預變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸,循環(huán)30次后72℃延伸5ｍｉｎ。第1次ＰＣＲ反應取模板10μＬ,第2次ＰＣＲ反應以第1次ＰＣＲ擴增產(chǎn)物為模板取1μＬ。

一種名為BM-Cyclin的化學(xué)試劑，除體外培養癌細胞中支原體污染具體方法：

      1、選用抗支原體藥物(BM-Cyclin-1、2 )，磷酸緩沖液配制，溶液抽濾除菌，0～4℃保存。

       2、細胞處理過(guò)程：細胞傳代同時(shí)加BM-Cyclin-1 10μg/ml，37℃培養3天；胰蛋白酶消化、傳代，加入BM-Cyclin-2 5μg/ml，37℃培養3天；繼續傳代追加BM-Cyclin-2 5μg/ml一次，培養2～4天(如細胞污染嚴重可重復上述處理過(guò)程)棄藥液，D-Hank’s液洗2次，胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行常規培養。

      3 、在細胞檢測或實(shí)驗前，最好再用常用量的5倍慶大霉素或卡那霉素作短時(shí)間處理，每天30～60分鐘。

      支原體的污染是目前細胞實(shí)驗室比較普遍存在的問(wèn)題，用藥物來(lái)殺滅支原體雖是一種重要措施，畢竟是一種補救方法，而且清除后，支原體仍可重新污染細胞。因此，重要的還在于預防，如嚴格選用無(wú)支原體污染的牛血清，保持細胞培養間潔凈和嚴格無(wú)菌操作等。