采用一系列方法將病毒工程化開(kāi)發(fā)用于疾病治療已經(jīng)成為一種新型的應用，該應用廣泛的定義為病毒療法，包括基因治療的病毒載體(Figure 1)和具有溶瘤細胞功能的病毒(Figure 2)。雖然這些產(chǎn)品大部分都處在臨床開(kāi)發(fā)階段，但是藥物作用靶點(diǎn)的多樣性以及未來(lái)創(chuàng )造財富的機會(huì )都是令人鼓舞的。病毒療法是一門(mén)以病毒為基礎的技術(shù)，一個(gè)重要 的挑戰就是在任何的時(shí)間點(diǎn)包括早期的研發(fā)，產(chǎn)品的生產(chǎn)，產(chǎn)品的包裝上市都能清楚地了解樣品的質(zhì)量和性能，其中最重要的一點(diǎn)就是病毒的定量。在過(guò)去，病毒的定量依賴(lài)于噬斑法和電鏡等方法，這些方法需要大量的勞動(dòng)力，等待很長(cháng)時(shí)間才能獲得結果，且獲得的結果具有很大的主觀(guān)性。然而，以新的病毒學(xué)技術(shù)的多樣性為基礎的病毒藥物和疫苗需要新的分析方法。在這篇文章中，我們將討論病毒計數儀3100實(shí)時(shí)地病毒濃度監測功能如何能顯著(zhù)的促進(jìn)病毒療法產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
Reprogramming Viruses to Treat Disease
基因治療早在十幾年前就已經(jīng)出現，但是因為出過(guò)病人死亡的情況而受挫。幸運的是，在2006年基因治療在臨床上 取得成功，所以基因治療又成為大家研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有2000多個(gè)臨床試驗在許多不同的治療領(lǐng)域中進(jìn)行或者已 經(jīng)完成?；蛑委熀推渌《警煼ㄗ畲蟮膮^別在于基因治療會(huì )將人體的一段健康基因傳遞到病人細胞中取代一個(gè)非功能性的片段。依賴(lài)于此方法，這段健康基因可能會(huì )或者不會(huì )持續整合到宿主細胞基因組中。相反，溶瘤細胞的病毒可 以利用許多方法去徹底破壞腫瘤細胞，而不是改變被感染細胞的基因組成。溶瘤細胞病毒療法包括裂解細胞，刺激抗腫瘤免疫反應，編碼能激活藥物前體成為有效細胞毒素的酶，抑制血管生成和放射療法敏化作用。
溶瘤細胞病毒療法的作用原理和機制如Figure2所示，該圖為Amgen公司所創(chuàng )，T-VEC 目前被用來(lái)研究黑色素瘤和其他晚期癌癥的治療，使用改進(jìn)的皰疹病毒選擇性感染癌細胞，分泌細胞因子來(lái)刺激免疫反應，已經(jīng)在三期臨床實(shí)驗中顯示了顯著(zhù)的成效。除了癌癥，病毒療法也被建議用來(lái)治療其他疾病，如用噬菌體治療細菌感染。
到目前為止，許多的病毒已經(jīng)在病毒療法應用中被評估過(guò)（見(jiàn) Table1）。之所以選擇這些病毒，是因為他們只瞄準特定的細胞 類(lèi)型或者適合基因操作。為了把這些病毒開(kāi)發(fā)成基因傳遞載體或 者治療因子，必須將這些病毒放大培養，在培養過(guò)程中優(yōu)化培養 條件以獲得最大的產(chǎn)量。在整個(gè)過(guò)程中如接種，體積放大培養， 收樣，純化，濃縮，病毒包裝等都存在延誤、中斷的機會(huì )。由于許多病毒定量方法都需要好幾天甚至好幾周的時(shí)間，容易打斷整 個(gè)流程，所以病毒定量是一個(gè)很大地瓶頸。病毒計數儀3100(Figure 3)幾分鐘內就能提供精確的，可重復的病毒顆粒定 量結果，能實(shí)時(shí)監測病毒的濃度。96孔板的自動(dòng)上樣系統，為GMP 要求設計的軟件能很好的滿(mǎn)足大規模的病毒生產(chǎn)環(huán)境所需的條件。
Proof of Principle
病毒計數儀已經(jīng)被廣泛應用于多種病毒的計數，包括基因傳遞載體和溶瘤功能的病毒。這里我們列出一些檢測的數據，顯示病毒計數儀快速的病毒定量在病毒療法領(lǐng)域的實(shí)用性。 病毒計數儀的精度通過(guò)檢測系列稀釋的病毒樣品數據斜率和線(xiàn)性關(guān)系來(lái)測量。這個(gè)值越接近1，說(shuō)明這個(gè)機器產(chǎn)生的數據越可信，越能反映病毒濃度的真實(shí)性。Figure 4 證實(shí)了這個(gè)實(shí)驗，在這個(gè)案例中檢測的是水痘病毒。 3個(gè)不同的樣品分別檢測了11個(gè)稀釋度，斜率分別為－1.0845，－1.0846， －1.14，R2 分別是0.995, 0.997 and 0.996，顯示出良好的精確性。
在下一個(gè)例子中，一個(gè)客戶(hù)想跟蹤HeLa細胞培養的麻疹病毒濃度。他們采用病毒計數儀測量總的病毒顆粒， 用TCID50（這個(gè)方法需要5-7天的時(shí)間）測量病毒的感染 性,并比較了兩者之間的關(guān)系（Figure 5）。與大部分的 病毒類(lèi)似，有感染能力的麻疹病毒的數量只是總病毒群體中的一小部分，在這個(gè)例子中只有0.6% to 1.7%，暗 示了此批次培養的病毒大部分是非感染性的病毒。有趣 的是，病毒感染的細胞培養了120多個(gè)小時(shí)后，感染性病 毒數量明顯下降，而病毒總量卻保持穩定不變，暗示病 毒的感染效力會(huì )受到培養時(shí)間延長(cháng)的不利影響。
此外，該客戶(hù)利用病毒計數儀跟蹤定量麻疹病毒在純化的每個(gè)步驟中病毒顆粒的濃度（Figure 6）， 該實(shí)驗闡明了病毒的實(shí)時(shí)定量在病毒純化過(guò)程中進(jìn)行優(yōu)化避免錯誤發(fā)生的重要性。沒(méi)有病毒計數儀的實(shí)時(shí)監測，任何人在生產(chǎn)、 純化病毒療法的藥劑時(shí)都是在黑暗中摸索，這意味著(zhù)需要冒著(zhù)百萬(wàn)美元的損失以及需要安全有效產(chǎn)品進(jìn)行治療的病人 的健康風(fēng)險。
（本文轉載：丁香通）
