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細菌血清學(xué)鑒定法

      血清學(xué)反應是指相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現肉眼可見(jiàn)的沉淀或凝集現象。在微生物檢驗中,常用血清學(xué)反應來(lái)鑒定分離到的細菌,以最終確認檢測結果,是臨床細菌性疾病診斷和病原菌鑒定的重要手段之一。血清學(xué)試驗可分為血清學(xué)鑒定和血清學(xué)診斷兩部分。用已知抗體(即含特異抗體的免疫血清或單克隆抗體等)檢測標本中或分離培養物中未知細菌的種、型或細菌抗原,稱(chēng)為血清學(xué)鑒定;而用已知細菌或特異性抗原檢測患者血清中有無(wú)相應抗體及其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化,作為某些感染性疾病的輔助診斷,稱(chēng)為血清學(xué)診斷。血清學(xué)試驗基本類(lèi)型包括凝集反應、沉淀反應和補體結合反應等。

一、玻片凝集試驗

【實(shí)驗目的】
 
1. 掌握玻片凝集試驗的操作方法,了解其特點(diǎn)和用途。
 
2. 學(xué)習玻片凝集試驗結果的觀(guān)察方法。

【實(shí)驗原理】
 
當顆粒性抗原與相應抗體特異結合后,在適量電解質(zhì)存在的條件下,可逐漸聚集,出現肉眼可見(jiàn)的凝集現象。

【試劑與器材】
 
1. 診斷血清:1∶10稀釋的傷寒桿菌診斷血清。
 
2. 菌種:傷寒桿菌、痢疾桿菌24 h瓊脂斜面培養物。
 
3. 器材:載玻片、毛細吸管。
 
4. 試劑:生理鹽水。
 
【實(shí)驗方法與步驟】
 
1. 取清潔玻片一張,用蠟筆劃為三格,并注明號碼。無(wú)菌操作下,用接種環(huán)于1、2格內加1∶10稀釋傷寒桿菌診斷血清1~2滴,第三格加1~2滴生理鹽水。
 
2. 無(wú)菌操作下,用接種環(huán)取傷寒桿菌培養物少許,混于第三格中,再混于第一格中(不能先混第一格再混第三格,因為這樣將使診斷血清混入鹽水而影響對照結果),將細菌與鹽水或血清混合均勻使呈乳狀液。此時(shí)取菌量不可過(guò)多,使懸液呈輕度乳濁即可。
 
3. 同法取痢疾桿菌培養物少許,于第二格內混勻。

4. 輕輕搖動(dòng)玻片,經(jīng)1~2min后肉眼觀(guān)察,出現乳白色凝集塊者,即為陽(yáng)性反應;仍為平等的乳濁液者,即為陰性反應。如結果不夠清晰,可將玻片放于低倍顯微鏡下觀(guān)察。

二、試管凝集反應——肥達反應

【實(shí)驗目的】
 
1. 掌握肥達的操作方法,了解其特點(diǎn)和用途。
 
 2. 學(xué)習肥達反應結果的觀(guān)察方法。

【實(shí)驗原理】
 
 試管凝集反應是一種半定量的凝集反應。常用已知抗原測定受檢血清中有無(wú)相應抗體及其含量,以輔助臨床診斷或供流行病學(xué)調查分析。

【試劑與器材】
 
1. 診斷血清:1∶10稀釋傷寒桿菌“H”血清、1∶10稀釋傷寒桿菌“O”血清。
 
2. 菌液:傷寒桿菌“H”菌液、傷寒桿菌“O” 菌液。
 
3. 試劑:生理鹽水。
 
4. 器材:小試管、吸管。

【實(shí)驗方法與步驟】
 
1. 取潔凈小試管14只分兩排排列于試管架上,每排7只依次用蠟筆注明號碼,于每管中分別加入0.5 ml生理鹽水。
 
2. 在第1排第1管中加入1∶10稀釋傷寒“H”血清0.5 ml,使血清與鹽水充分混合,而后吸出0.5 ml注入第2管,同樣予以混勻后吸出0.5 ml注入第3管。以此類(lèi)推,稀釋到第6管,自第6管吸出0.5 ml棄去。此時(shí),自第1管至第6管的血清稀釋倍數為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640。第7管不加血清作為對照。
 
3. 同法用吸管吸取1∶10稀釋傷寒桿菌“O”血清加入第2排第1管,并依次如上法予以稀釋。
 
4. 用移液管吸取傷寒桿菌“H”菌液,加入第1排各管中每管0.5 ml,此時(shí)血清稀釋倍數又增加了一倍。
 
5. 同法于第2排各管中加入傷寒“O”菌液0.5 ml。
 
6. 將各管振蕩混勻,放37℃水浴箱中2~4h或37℃孵育箱中過(guò)夜,次日取出觀(guān)察結果。

【觀(guān)察結果】
1. 對照管無(wú)凝集現象,管內液體仍呈混濁狀態(tài)。但如放置時(shí)間較長(cháng),細菌堆于管底成小圓點(diǎn)狀,為陰性反應。
 

2. 試驗管與對照相比可見(jiàn)管底有不同大小的圓片狀邊緣不整齊的凝集物,上清則澄清透明或不同程度混濁。凝集的強弱可用“+”號表示如下:


“++++”凝集很強,管內液體完全澄清,凝集塊完全沉于管底;
“+++”凝集強,管內液體不完全澄清稍有輕度混濁,凝集塊沉于管底;
“++”凝集中等強度,液體半澄清,凝集塊沉于管底;
“+”凝集弱,管內液體混濁,少量凝集塊沉于管底;
“-”不凝集,管內液體和對照管同樣混濁,無(wú)凝集塊。
 
3. 記錄觀(guān)察的結果并判斷凝集效價(jià)。通常以能產(chǎn)生明顯凝集(++)的血清大于稀釋倍數作為該血清的凝集效價(jià)。如血清的最低稀釋度(即第1管1:40)仍無(wú)凝集應報告為低于1:40。如血清的最高稀釋度(即第6管1:1280)仍顯完全凝集現象,應報該血清效價(jià)高于1:1280。

【注意事項】
 
 觀(guān)察切勿搖動(dòng)試管,以免凝集塊分散。

思 考 題

  1. 生理生化反應鑒別細菌的原理是什么?

  2. 細菌生理生化反應試驗中為什么要設對照?

  3. 血清學(xué)試驗有哪些類(lèi)型類(lèi)型?

  4. 影響血清學(xué)試驗的因素有哪些?
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