Eliane Escher是瑞士蘇黎世大學(xué)分子生物學(xué)研究所測序中心的管理者。這個(gè)研究小組每月常規進(jìn)行1500到2000個(gè)測序反應，以質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物和細菌人工染色體（BAC）DNA作為循環(huán)測序的模板。Escher女士利用BigDye? Terminator循環(huán)測序試劑盒、GeneAmp? 9700 PCR系統和3730 DNA測序儀，以一種改進(jìn)的方法*對BAC DNA進(jìn)行測序。此外，Escher女士的研究小組發(fā)現利用BigDye? XTerminator?純化試劑盒進(jìn)行反應純化，能增加信號強度，并從整體上改善序列數據的讀取質(zhì)量，產(chǎn)生與質(zhì)粒模板相當的結果。

     關(guān)于細菌人工染色體（BAC）

     一般說(shuō)來(lái)，細菌人工染色體（BAC）DNA的測序比質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物的測序要困難得多。它片段長(cháng)（一般大于100 Kb），會(huì )形成二級結構，可能由于二級結構區域后的DNA鏈延伸不夠充分而導致測序異常。BAC測序需要毫克級高純度的DNA，從而獲得充足信號，以利于準確的堿基信號檢出和最大讀長(cháng)。
細菌人工染色體（BAC）測序流程的優(yōu)化

     Escher女士所在測序中心的工作量很大，他們需要一種省時(shí)又經(jīng)濟的測序方法來(lái)對細菌人工染色體（BAC）樣品進(jìn)行常規分析。從過(guò)夜培養的細菌培養物中純化細菌人工染色體（BAC） DNA，然后用BigDye Terminator v3.1 循環(huán)測序試劑盒在GeneAmp 9700 PCR系統上進(jìn)行測序。Escher女士最初使用的步驟是針對質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物測序而開(kāi)發(fā)的熱循環(huán)條件。然而，這種方法導致BAC DNA序列質(zhì)量不高，以及大量未摻入的染料終止子（“染料團”）。

     為了解決這個(gè)問(wèn)題，Escher女士修改了*熱循環(huán)條件，延長(cháng)最初的變性步驟，并增加了測序循環(huán)的數量。她還在先采用了BigDye XTerminator 純化試劑盒進(jìn)行循環(huán)測序反應產(chǎn)物的純化，然后才用美國應用生物系統公司的3730 DNA測序儀進(jìn)行毛細管電泳分析。同時(shí)平行分析質(zhì)粒模板作為對照。11個(gè)獨立樣品的分析數據顯示與初始步驟相比，結果有了很大改善。

更高質(zhì)量的BAC序列數據

     Escher女士發(fā)現，用BigDye Terminator v3.1循環(huán)測序試劑盒及改良的步驟，使BAC DNA的測序質(zhì)量達到甚至超過(guò)質(zhì)粒測序中所得到的結果。在測序流程中加入BigDye XTerminator純化試劑盒，能極大改善大型細菌人工染色體 DNA樣品測序所面臨的挑戰。與Sephadex純化相比，BigDye XTerminator純化試劑盒純化的BAC序列數據的信號強度顯著(zhù)得到改善。根據Escher女士的實(shí)驗結果，在BAC測序中使用BigDye XTerminator純化試劑盒可穩定地去除染料污染，從而消除了干擾序列分析的假象。關(guān)于Escher女士使用的操作步驟，請參考美國應用生物系統公司的應用指南“從細菌人工染色體（BAC）DNA獲取高質(zhì)量的測序數據的流程”，P/N 107AP05-01