1.1 慢病毒技術(shù)的原理

   慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種。構建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達載體構建的普通siRNA 載體相比，一方面可以擴增替代瞬時(shí)表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過(guò)慢病毒包裝系統包裝后，可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進(jìn)行長(cháng)時(shí)間的穩定表達。在研究RNAi方面，慢病毒技術(shù)是最為有效的一種解決方案。

   1.2 特點(diǎn)

    <!--[if !supportLists]-->1） <!--[endif]-->直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合RNAi 研究和體內實(shí)驗中難于轉染的細胞(比如神經(jīng)元細胞、干細胞或其它原代細胞)。

   2） 可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內獲得穩定表達特定基因的多種細胞株。

   3） 可用于基因敲除、基因治療和轉基因動(dòng)物研究。

   4） 無(wú)需任何轉染試劑，操作簡(jiǎn)便。

   5） 可以根據需要制備多種標記。

   1.3 慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程

   1） 含有目的基因的慢病毒RNAi 干擾載體的構建和質(zhì)粒純化提取。

   2） 慢病毒載體，包裝系統共轉染病毒包裝細胞293T等。

   3） 培養48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養液。

   4） 病毒的純化和濃縮。

   5） 分裝、- 80 ℃保存。

   6） 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。

   2、慢病毒使用操作手冊

   2.1 慢病毒的儲存與稀釋:

   2.1.1 病毒的儲存：收到病毒液后在很短時(shí)間內即使用慢病毒進(jìn)行實(shí)驗，可以將病毒暫時(shí)放置于4 ℃保存；如需長(cháng)期保存請放置于-80℃（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）

注意事項：

   A． 病毒可以存放于-80℃ 6個(gè)月以上；但如果病毒儲存時(shí)間超過(guò)6個(gè)月，我們建議在使用前需要重新滴定病毒滴度；

   B． 反復凍融會(huì )降低病毒滴度：每次凍融會(huì )降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過(guò)程中應僅盡量避免反復凍融，為避免反復凍融建議大家收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。

   2.1.2 病毒的稀釋?zhuān)盒枰♂尣《緯r(shí)，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養目的細胞用PBS或無(wú)血清培養基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)混勻分裝后4℃保存(請盡量在三天內用完)分裝后使用。

   2.2 慢病毒用于體外（In Vitro）實(shí)驗：感染培養原代細胞和建系

   2.2.1 慢病毒對各種細胞和組織的親嗜性：慢病毒對各種細胞和組織的親嗜性不同，使用慢病毒之前可以通過(guò)查閱相關(guān)文獻，了解慢病毒對您的目的細胞的親嗜性，感染復數（MOI 值）以及在體外（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒(méi)有相關(guān)文獻支持，可以通過(guò)感染預實(shí)驗得到合適的感染復數（MOI值）（使用24孔板檢測病毒對目的細胞的親嗜性）。

   2.2.2 慢病毒感染目的細胞預實(shí)驗

   2.2.2.1 慢病毒感染目的細胞預實(shí)驗注意事項

   A． 測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時(shí)，需要同時(shí)設置對慢病毒親嗜性較高的細（HEK293T，Hela） 細胞作為平行實(shí)驗的對照細胞。

   B． 在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗時(shí),可以用完全培養基（培養目的細胞用）稀釋?zhuān)焕碚撋?，含有血清，雙抗或者其他營(yíng)養因子的完全培養基不影響慢病毒的感染效率。

   C．每個(gè)公司提供的病毒單位有可能不同，要了解清楚。例如： western Biotechnology提供的病毒單位為T(mén)U/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數。

   2.2.2.2 以24孔培養板為例，進(jìn)行目的細胞和HEK293T 細胞的感染預實(shí)驗

   實(shí)驗前按照不同的MOI設置不同的感染孔，并根據MOI和細胞數量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無(wú)血清培養基稀釋病毒原液

   A. 第一天，準備細胞：在24孔培養板接種若干孔，每個(gè)孔內接種3-5X104個(gè)目的細胞，鋪板時(shí)細胞的融合率為50%左右，每孔培養基體積為100 μl；進(jìn)行病毒感染時(shí)細胞的融合度約為70%左右。

   B. 第二天，準備病毒：取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據實(shí)驗室的實(shí)際情況將按照MOI準確計算好的慢病毒稀釋到培養基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。

   第二天，感染目的細胞：病毒準備好之后，從培養箱中拿出細胞，首先觀(guān)察細胞生長(cháng)狀態(tài)，如細胞狀態(tài)較好則開(kāi)始實(shí)驗：

   a 使用移液器吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養基；

   b 吸去培養基的培養器皿中的培養基（如果細胞生長(cháng)良好，密度適宜，則不用換液）；

   c 在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液；

   d 混勻后放于二氧化碳培養箱（37℃、5%CO2）孵育過(guò)夜。