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細胞轉染實(shí)驗之如何做好脂質(zhì)體介導DNA轉染

     脂質(zhì)體介導是目前條件下最方便的轉染方法之一,適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中,其轉染率高,優(yōu)于磷酸鈣法,比它高5100倍,能把DNARNA轉染到各種細胞。
LR進(jìn)行轉染時(shí),首先需優(yōu)化轉染條件,應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時(shí)間等,對每批LR都要做:第一,先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時(shí)間,DNA可從15μg和孵育時(shí)間6小時(shí)開(kāi)始,按這兩個(gè)參數繪出相應LR需用量的曲線(xiàn),再選用LRDNA兩者最佳的劑量,確定出轉染時(shí)間(224小時(shí))。因LR對細胞有一定的毒性,轉染時(shí)間以不超過(guò)24小時(shí)為宜。


     脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。


     細胞種類(lèi):COS-7、BHK、NIH3T3、HelaJurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。 


     方法一、操作步驟 


     1. 6孔培養板(或用35mm培養皿),向每孔中加入2mL12×105 個(gè)液,37℃CO2 培養至40%60%匯合時(shí)(匯合過(guò)分,轉染后不利篩選細胞)。 


     2. 轉染液制備:在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個(gè)孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA,終量100μL,B液:用不含血清培養基稀釋2-50μgLR,終量100μL,輕輕混合A、B液,室溫中置10-15分鐘,稍后會(huì )出現微濁現象,但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LRDNA濃度過(guò)高所致,應酌情減量)。


     3. 轉染準備:用2mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入1mL不含血清培養液。 


     4. 轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置624小時(shí),吸除無(wú)血清轉染液,換入正常培養液繼續培養。 


     5. 其余處理如觀(guān)察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。 


     注意:轉染時(shí)切勿加血清,血清對轉染效率有很大影響。 


     方法二、快速脂質(zhì)體轉染法 


     1. 5×105 細胞/孔接種6孔板(35mm培養皿)培養24小時(shí),使其達到5060%板底面積。 


     2. 在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復合物方法如下: 


     ①1mL無(wú)血清DMEM 中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。 


     ②旋轉1秒鐘,再加入脂質(zhì)體懸液,旋轉。 


     ③室溫下放置510分鐘,使DNA結合在脂質(zhì)體上。 


     3. 棄去細胞中的舊液,用1mL無(wú)血清DMEM洗細胞一次后棄去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復合物,37℃培養35小時(shí)。 


     4. 再于每孔中加入20%FCSDMEM,繼續培養1424小時(shí), 


     5. 吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCSDMEM,2mL/孔,再培養2448小時(shí)。 


     6. 用細胞刮或消化法收集細胞,以備分析鑒定。 


     方法三、穩定的脂質(zhì)體轉染 


     1. 接種細胞同前,細胞長(cháng)至50%板底面積可用于轉染。 


     2. DNA/脂質(zhì)體復合物制備轉染細胞同前2、3步驟。 


     3. 在每孔中加入1mL、20%FCSDMEM,37℃培養48小時(shí)。 


     4. 吸出DMEM,用G418選擇培養液稀釋細胞,使細胞生長(cháng)一定時(shí)間,篩選轉染克隆 ,方法參照細胞篩選法進(jìn)行。

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