四唑鹽（MTT）比色法可以：（1）檢測細胞存活和生長(cháng)；（2）大規模的抗腫瘤藥物篩選；（3）細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定；（4）生物活性因子的活性檢測。

 
實(shí)驗方法原理： MTT法是Mosmann 1983年報道的，以后此方法得到了迅速發(fā)展并廣泛應用于臨床與科研研究。其原理是活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

實(shí)驗材料： 細胞樣品
試劑、試劑盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸緩沖液二甲亞楓
儀器、耗材： 加樣器96孔培養板酶標儀培養板

實(shí)驗步驟

 一、實(shí)驗前應明確的問(wèn)題
 
1.  選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長(cháng)滿(mǎn)時(shí)約有105個(gè)細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，要進(jìn)行預實(shí)驗檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細胞數條件下的生長(cháng)曲線(xiàn)，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時(shí)間，以保證培養終止致細胞過(guò)滿(mǎn)。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線(xiàn)性關(guān)系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀(guān)察不到差異。
 
2.  藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時(shí)間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。
 
3.  時(shí)間點(diǎn)的設定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線(xiàn)，曲線(xiàn)什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因為這個(gè)時(shí)候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。
 
4.  培養時(shí)間。200 ul的培養液對于10的4~5次方的增殖期細胞來(lái)說(shuō)，很難維持68 h，如果營(yíng)養不夠的話(huà)，細胞會(huì )由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48 h換液的。
 
5.  MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
 
6.  理論未必都是對的。要根據自己的實(shí)際情況調整。
 
7.  實(shí)驗時(shí)應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。
 
8.  避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì )影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會(huì )試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

二、貼壁細胞
 
1.  收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ul，鋪板使待測細胞調密度至1 000-10 000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。
 
2.  5% CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿(mǎn)孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度，每孔100 ul，設3-5個(gè)復孔.建議設5個(gè)，否則難以反應真實(shí)情況。
 
3.  5% CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。
 
4.  每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。
 
5.  終止培養，小心吸去孔內培養液。
 
6.  每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
 
7.  同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜）
 
三、懸浮細胞
 
1.  收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將

（1）補足的1640（無(wú)血清）培養基40 ul ；

（2）加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養液稀釋 （儲存液100 ug/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1：10-1：20）；

（3）需檢測物10 ul；

（4）細胞懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設對照（加100 ul 1640）。
 
2.  置37℃，5% CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀(guān)察。
 
3.  每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
 
4.  離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
 
5.  同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設定3復孔。
 
四、MTT的配制
 
MTT一般最好現用現配，過(guò)濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(cháng)期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現配，直接往培養板中加，沒(méi)必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對不能再用了。
 
MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.
 
配制MTT時(shí)用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。
 
1.  PBS配方
 
（1）NaCl ：8 g。
 
（2）KCl 0.2：g。
 
（3）Na2HPO4 ：1.44 g。
 
（4）KH2PO4：0.24 g。
 
（5）調pH7.4。
 
（6）定容1 L。
 
五、細胞的接種（鋪板）
 
細胞過(guò)了30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復利用的板只可做預實(shí)驗。
 
接種時(shí)最好按照預實(shí)驗摸索出的密度接種， 因為細胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線(xiàn)性關(guān)系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會(huì )很明顯，太密細胞可能都會(huì )凋亡，因為細胞長(cháng)的太快營(yíng)養會(huì )不夠，最后導致死亡。且而細胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì )過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線(xiàn)性關(guān)系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100 ul/孔。
 
細胞密度要根據不同細胞的特點(diǎn)來(lái)定.如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105，貼壁細胞可為103-104。
  
注意事項：
1.  選擇適當得細胞接種濃度。
 
2.  避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
 
3.  設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。
 
MTT實(shí)驗吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋?zhuān)嘧鎏荻?，做點(diǎn)線(xiàn)圖即可！
 
舉個(gè)例子：
 
各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21、0.06。代入計算公式：
 
Pm=0.95
 
Pn=0.06
 
P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
 
Xm=lg0.1=-1
 
lgI=lg0.1/0.01=1
 
lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
 
IC50=0.00025
 
參考公式：
 
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
 
Xm:lg 最大劑量
 
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
 
P:陽(yáng)性反應率之和
 
Pm: 最大陽(yáng)性反應率
 
Pn: 最小陽(yáng)性反應率
 
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值
 
公式中的最大最小陽(yáng)性反應率就是最大最小抑制率
 
例：
 
用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適根據書(shū)上說(shuō)的加200 ul 1640，20 u lMTT，150 ul DMSO加DMSO之前要盡量去掉培養液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定，一般每孔4000個(gè)細胞為宜，既細胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20 ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150 ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。
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一、經(jīng)驗總結

1.  首先細胞的接種密度一定不能過(guò)大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話(huà)SD值會(huì )很大。
 
2.  MTT本身就是比較粗的實(shí)驗，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20%的波動(dòng)也是常見(jiàn)的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。
 
3.  我做的是腫瘤細胞的MTT實(shí)驗，這種細胞長(cháng)的很快一開(kāi)始我是用100000/ML的濃度來(lái)接種的，結果細胞長(cháng)的太滿(mǎn)結果是沒(méi)有梯度也沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系.后來(lái)調整濃度，用過(guò)40000~80000/ML的濃度都做過(guò)MTT實(shí)驗，結果發(fā)現做的結果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組，由于細胞少，藥物作用的梯度還是有，只是沒(méi)有很好的線(xiàn)性關(guān)系.還有根據細胞生長(cháng)速度以及藥物的特性（有時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性的藥物）來(lái)確定培養時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).
 
4.  注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來(lái)，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會(huì )在8%左右。另外，吹散次數過(guò)多也會(huì )影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

二、實(shí)驗心得分享

1.  吹打時(shí)懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3-4倍，可能比較容易混勻。10 ml的離心管里面最好裝3-4 ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。
 
2.  吸管的吸液量最好在1 ml左右：吸液量過(guò)多的話(huà)，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì )不均勻。如果是吸液量1 ml多的吸管，總液量在5 ml左右為益。
 
3.  吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來(lái)一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開(kāi)液面，否則容易吹打出氣泡。
 
4.  吹打次數100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30-50次基本就差不多均勻了。加細胞的時(shí)候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）
 
5.  向每孔中用槍頭加入細胞時(shí)不要太快，否則你會(huì )發(fā)現細胞在加入的瞬間會(huì )由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì )產(chǎn)生接觸抑制，影響細胞的生長(cháng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動(dòng)，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗的關(guān)鍵，也是基礎，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞。