單細胞分析 樣品制備怎么破
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-24
物以稀為貴，這對于很多無(wú)法培養的細菌而言，更是如此。它們代表了珍貴的微生物種類(lèi)。斯坦福大學(xué)的Stephen Quake教授曾說(shuō)過(guò)，已經(jīng)被培養的細菌種類(lèi)不足1%。
鑒于無(wú)法培養的生物體在它們所居住的環(huán)境中扮演了關(guān)鍵的角色，這種信息鴻溝代表了一個(gè)重大的問(wèn)題，Quake的團隊將其稱(chēng)之為生物學(xué)中的“暗物質(zhì)”問(wèn)題。從更實(shí)際的角度來(lái)看，這些細胞也許含有新穎的酶以及生物學(xué)或藥學(xué)上有用的分子，如抗生素。
研究人員已經(jīng)設計出幾種策略來(lái)研究無(wú)法培養的微生物，包括16S rRNA測序和宏基因組學(xué)。不過(guò)，現在還有另一種越來(lái)越流行的方法：?jiǎn)渭毎蚪M學(xué)。
單細胞基因組學(xué)顧名思義，研究人員分離出單個(gè)細胞并裂解，然后擴增并測序基因組DNA。它所產(chǎn)生的組裝可能并非完整的，因為任何損失或擴增偏向都會(huì )導致序列數據丟失，不過(guò)，它帶來(lái)了其他方法無(wú)法獲得的信息?，F在的問(wèn)題是，如何分離單個(gè)細胞。
據美國能源部微生物基因組學(xué)計劃的主管Tanja Woyke介紹，研究人員使用幾種方法分離單細胞，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。Quake曾使用微流體方法來(lái)分離一種稱(chēng)為TM7的無(wú)法培養微生物1。TM7是桿狀的，于是Quake及其團隊專(zhuān)門(mén)捕獲口腔微生物群落中的桿狀細菌。隨后他們通過(guò)核糖體RNA來(lái)追蹤所要的細胞。在35個(gè)分離的桿狀細菌中，4個(gè)都證明是TM7，他們對其中一個(gè)進(jìn)行測序。
Woyke認為，微流體方法有兩個(gè)主要優(yōu)勢。第一，用戶(hù)能夠觀(guān)察他們正在分離的細胞，這讓他們能夠選擇特定的形態(tài)或表型，并將此信息與基因型相關(guān)聯(lián)。第二是擴增效率。單拷貝的細菌基因組顯然不夠用來(lái)測序，因此需要全基因組擴增。但并非所有片段都能同等擴增，一些可能會(huì )丟失。“一些研究表明，如果反應體積越小，那么單細胞基因組的回收就越好，覆蓋也更加均一，”Woyke說(shuō)。
盡管如此，微流體策略通常是低通量的，且只有少數實(shí)驗室能夠接觸到這種設備。一個(gè)商業(yè)化的選擇是Fluidigm的C1?單細胞自動(dòng)制備系統，這個(gè)微流體系統能夠自動(dòng)化分離和制備96個(gè)單細胞的測序文庫。不過(guò)，它只適用于哺乳動(dòng)物細胞，目前不支持細菌分離。
另一種單細胞分離方法是顯微操作，其中研究人員使用操縱桿驅動(dòng)的玻璃毛細管來(lái)挑選單個(gè)細胞，并依次轉移到目的容器中。
Woyke表示，她偶爾會(huì )使用這種方法，主要是在處理低復雜度的樣品時(shí)，在2010年發(fā)表的一篇文章中，她和她的同事對一種昆蟲(chóng)的細菌共生體進(jìn)行測序，根據它獨特的形態(tài)將其與另一種共生體分離2。“這就是主要優(yōu)勢，”Woyke說(shuō)。“你可以看到細胞。”不過(guò)，顯微操作的通量也非常低。若細胞能游動(dòng)或有粘性，則很棘手。在微生物單細胞基因組學(xué)中，兩種比較少用的分離方法是激光捕獲顯微切割和連續稀釋?zhuān)?/span>Woyke對后者的評價(jià)是“最便宜且最不準確”的選擇。
最流行的策略是熒光激活細胞分選（FACS）。比奇洛海洋科學(xué)實(shí)驗室（Bigelow Laboratory for Ocean Sciences）單細胞基因組學(xué)中心的主任Ramunas Stepanauskas使用兩臺FACS儀器，一臺是貝克曼?庫爾特的MoFlo?，另一臺是BD的BD? Influx?。他對細胞分選的看法是：“這是個(gè)非常強大且高通量的技術(shù)，經(jīng)過(guò)了幾十年的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)。它讓我們能夠在幾分鐘內處理數千個(gè)細胞。”與其他方法相比，FACS帶來(lái)了兩個(gè)主要優(yōu)勢。其一是通量，流式系統能夠快速將單個(gè)細胞分選到384孔板中，這一速度是手動(dòng)方法難以企及的。其二是FACS能夠按照特定條件來(lái)選擇細胞，如特定顏色、核酸或生物化學(xué)活性的存在。
Woyke、Stepanauskas及其同事在2014年的《Nature Protocols》文章3中寫(xiě)道：“由于其高的速度和通量，以及根據各種細胞特性分離單個(gè)細胞的能力……FACS已成為[單細胞基因組學(xué)中]首選的單細胞分離方法。”
2012年，Stepanauskas通過(guò)將樣品與熒光標記的海帶多糖和木聚糖一起孵育，分離出能夠降解某些多糖的水生細菌4。他們還利用CTC（5-氰基-2,3-芐基-四唑氯化物）富集具代謝活性的細胞。
另一方面，傳統的FACS不可能捕獲你正在收集的各個(gè)細胞的圖像。而且由于它的體積比微流體方法更大，之后的擴增效率可能受影響，Woyke談道。她的解決方案是使用Labcyte的Echo? 來(lái)代替傳統的液體處理系統，這一系統利用聲能來(lái)分配納升級液體，讓反應體積最小化。
據BD Biosciences的副總裁Robert Balderas介紹，如今的細胞分選儀能夠根據多達20個(gè)參數（如細胞大小和顆粒度）來(lái)過(guò)濾細胞，顏色可達到18種。他認為，任何分選儀都能開(kāi)展單細胞的工作，不過(guò)它們的能力有所不同。最重要的是用戶(hù)的需求。他們是否需要從復雜的混合群體中分離特定的細胞群，需要更復雜的分選策略，以及更多的顏色？“最重要的事情是科學(xué)，”他說(shuō)。遠離污染。Woyke認為，單細胞基因組學(xué)成功的關(guān)鍵是清潔度。“污染是我們在單細胞基因組中的重大敵人，”她說(shuō)。由于所使用的DNA量極少，痕量的污染也會(huì )在擴增后放大，因此從頭到尾都需要一個(gè)非常干凈的過(guò)程，一塊專(zhuān)門(mén)的區域，以及專(zhuān)門(mén)的移液器和液體處理系統。
除此之外，用戶(hù)需要做的就是照著(zhù)Protocol來(lái)做，這并不難。Woyke指出，有些公司如今提供專(zhuān)為單細胞基因組擴增而設計的超純試劑盒，能盡量避免污染問(wèn)題。（QIAGEN的REPLI-g試劑盒就是這樣的產(chǎn)品，索取詳細資料。）盡管如此，考慮到復雜性、儀器和數據分析問(wèn)題，Stepanauskas認為單細胞基因組學(xué)方面的新手可能會(huì )考慮外包。“你需要專(zhuān)門(mén)的設備和訣竅才能做好。我不建議人們包攬一切，”他談道。
