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熒光定量PCR詳細流程和問(wèn)題解析(一)

      前一段時(shí)間在百度中搜索,發(fā)現多年前寫(xiě)的一個(gè)關(guān)于熒光定量PCR技術(shù)的PPT有很多人看過(guò)或引用過(guò),考慮到自己作熒光定量PCR工作已經(jīng)了五年了,做的實(shí)驗以及解決的問(wèn)題遠比五年前多了,因此利用過(guò)年的時(shí)間,寫(xiě)點(diǎn)熒光定量PCR實(shí)驗中的一些注意事項及感想,無(wú)論對錯,都是希望對相關(guān)的人員有些參考價(jià)值。
  

      熒光定量PCR原理等大家都已經(jīng)很熟了,我就不細說(shuō)了,主要是寫(xiě)一些有人問(wèn)過(guò)的事,希望寫(xiě)的內容是大家都關(guān)心的。
  

普通PCR與熒光定量PCR技術(shù)區別?

 

      簡(jiǎn)單的講PCR技術(shù)最早是用于擴增一段特異的PCR片段,用于克隆、測序等實(shí)驗,后來(lái)也將其用于樣本中特異的PCR片段有無(wú)或非很粗的相對定量,而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對及絕對量,是一種測定特異的PCR片段含量的方式。如測定病人樣本中病原體的含量、實(shí)驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。
  

     前些年有人講過(guò)普通PCR后,通過(guò)電泳也可以進(jìn)行定量,其實(shí)是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。近兩年沒(méi)有人再講這類(lèi)的話(huà)了。
  

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX這些方法如何選擇?
  

      從實(shí)驗成本來(lái)講,Sybr Green是最好的,基本上就是普通PCR加上一點(diǎn)Sybr Green I 熒光染料即可,其信號強度也很好,還可以進(jìn)行融解曲線(xiàn)分析等,但缺點(diǎn)是只能在一個(gè)反應管內進(jìn)行一種PCR反應的檢測,另一個(gè)問(wèn)題是非特異性擴增會(huì )影響實(shí)驗結果,當然也有一些技術(shù)解決這些問(wèn)題,后面會(huì )講到。對于研究人員來(lái)講,如果需要檢測的基因很多,而每個(gè)反應管中進(jìn)行一種PCR反應的檢測可以滿(mǎn)足實(shí)驗要求,則Sybr Green是最好的選擇。
  

      如果需要進(jìn)行多通道實(shí)驗,即在一個(gè)反應管中進(jìn)行2種或以上的反應,則要選擇其他的方法,最常用的是Taqman、Molecular beacon,這兩種都是探針的方式,由于增加了探針的特異性,因此其擴增曲線(xiàn)反映的就是特異性產(chǎn)物的擴增曲線(xiàn),不含有非特異性擴增的成分。因此商業(yè)用途的檢測試劑盒大都采用這一技術(shù),以減少非特異性產(chǎn)物造成錯誤結論的可能性。其缺點(diǎn)在于探針成本較高,有時(shí)設計的探針并不合適,有造成損失的可能性。并且要進(jìn)行較多的實(shí)驗條件的優(yōu)化。這兩種探針技術(shù)用于商業(yè)目的時(shí)都有專(zhuān)利問(wèn)題,據說(shuō)取得Molecular beacon的許可權的成本相對較低,但只是據說(shuō)。
  

      另一種值得一提的是LUX探針,它也可進(jìn)行多通道實(shí)驗,但它沒(méi)有Taqman和Molecular beacon方法的增加探針特異性的功能,因此只能是一種折中的方案,如果不考慮多通道實(shí)驗,則不如Sybr Green法.

      (本文轉載丁香通

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