前一段時(shí)間在百度中搜索，發(fā)現多年前寫(xiě)的一個(gè)關(guān)于熒光定量PCR技術(shù)的PPT有很多人看過(guò)或引用過(guò)，考慮到自己作熒光定量PCR工作已經(jīng)了五年了，做的實(shí)驗以及解決的問(wèn)題遠比五年前多了，因此利用過(guò)年的時(shí)間，寫(xiě)點(diǎn)熒光定量PCR實(shí)驗中的一些注意事項及感想，無(wú)論對錯，都是希望對相關(guān)的人員有些參考價(jià)值。
  

      熒光定量PCR原理等大家都已經(jīng)很熟了，我就不細說(shuō)了，主要是寫(xiě)一些有人問(wèn)過(guò)的事，希望寫(xiě)的內容是大家都關(guān)心的。
  

普通PCR與熒光定量PCR技術(shù)區別？

      簡(jiǎn)單的講PCR技術(shù)最早是用于擴增一段特異的PCR片段，用于克隆、測序等實(shí)驗，后來(lái)也將其用于樣本中特異的PCR片段有無(wú)或非很粗的相對定量，而熒光定量PCR技術(shù)則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對及絕對量，是一種測定特異的PCR片段含量的方式。如測定病人樣本中病原體的含量、實(shí)驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。
  

     前些年有人講過(guò)普通PCR后，通過(guò)電泳也可以進(jìn)行定量，其實(shí)是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。近兩年沒(méi)有人再講這類(lèi)的話(huà)了。
  

Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX這些方法如何選擇？
  

      從實(shí)驗成本來(lái)講，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一點(diǎn)Sybr Green I 熒光染料即可，其信號強度也很好，還可以進(jìn)行融解曲線(xiàn)分析等，但缺點(diǎn)是只能在一個(gè)反應管內進(jìn)行一種PCR反應的檢測，另一個(gè)問(wèn)題是非特異性擴增會(huì )影響實(shí)驗結果，當然也有一些技術(shù)解決這些問(wèn)題，后面會(huì )講到。對于研究人員來(lái)講，如果需要檢測的基因很多，而每個(gè)反應管中進(jìn)行一種PCR反應的檢測可以滿(mǎn)足實(shí)驗要求，則Sybr Green是最好的選擇。
  

      如果需要進(jìn)行多通道實(shí)驗，即在一個(gè)反應管中進(jìn)行2種或以上的反應，則要選擇其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，這兩種都是探針的方式，由于增加了探針的特異性，因此其擴增曲線(xiàn)反映的就是特異性產(chǎn)物的擴增曲線(xiàn)，不含有非特異性擴增的成分。因此商業(yè)用途的檢測試劑盒大都采用這一技術(shù)，以減少非特異性產(chǎn)物造成錯誤結論的可能性。其缺點(diǎn)在于探針成本較高，有時(shí)設計的探針并不合適，有造成損失的可能性。并且要進(jìn)行較多的實(shí)驗條件的優(yōu)化。這兩種探針技術(shù)用于商業(yè)目的時(shí)都有專(zhuān)利問(wèn)題，據說(shuō)取得Molecular beacon的許可權的成本相對較低，但只是據說(shuō)。
  

      另一種值得一提的是LUX探針，它也可進(jìn)行多通道實(shí)驗，但它沒(méi)有Taqman和Molecular beacon方法的增加探針特異性的功能，因此只能是一種折中的方案，如果不考慮多通道實(shí)驗，則不如Sybr Green法.

      （本文轉載丁香通）