引物序列的特異性是決定PCR特異性擴增的主要因素?,F在我們常用引物設計軟件來(lái)進(jìn)行引物設計,但如注意到以下條件將會(huì )事半功倍
(1)引物長(cháng)度在15~30 bp為佳,過(guò)長(cháng)的引物與模板復性雜交速率減慢,降低擴增效率,過(guò)短則會(huì )降低特異性。
(2)引物內部不應形成二級結構,兩引物之間不能互補。
(3)堿基應隨機分布,(G+C)%最佳含量在45%~55%,應避免4個(gè)以上的相同堿基排列。
(4)引物3’端和模板的堿基最好完全配對,而引物3’端最后5~6個(gè)核苷酸與模板的錯配應盡可能少。
(5)引物3’端堿基最好是T、G、C而不是A,這樣會(huì )有利于延伸。
(6)可在引物5’端添加不與模板互補的額外序列以便于后續分析。
(本文轉載丁香通)