質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗技術(shù)。 

      質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程。 

實(shí)驗目的 

      掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

實(shí)驗材料 

      含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。 

 實(shí)驗原理 

      在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細菌的線(xiàn)性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

實(shí)驗步驟 

      1.取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LA培養基上37℃過(guò)夜培養； 

      2.用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養基中，37℃搖床~250 r/min過(guò)夜培養； 

      3.吸取1.5 ml菌液，12000 g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈； 

      4.加入300 ml溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或碎塊）； 

      5.加入300 ml溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過(guò)5分鐘； 

      6.加入300 ml溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀； 

      7.12000 g離心10分鐘； 

      8.吸取800 ml上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘； 

      9.12000 g 常溫離心15分鐘； 

      10.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）； 

      11.室溫放置或超凈臺上風(fēng)干DNA； 

      12.加40 ml滅菌超純水或TE溶解； 

      13.質(zhì)粒、BAC的質(zhì)量檢測，于-20℃保存。 

附注：質(zhì)粒檢測 

電泳檢測：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線(xiàn)型三種構型 

吸光值檢測：采用分光光度計檢測260nm、280nm波長(cháng)吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說(shuō)明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說(shuō)明有RNA污染。

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