實(shí)驗方法原理
MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑藍為基礎。MTT 為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料,可作用于活細胞線(xiàn)粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環(huán)開(kāi)裂,生成藍色的 formazan 結晶,formazan 結晶的生成量?jì)H與活細胞數目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將 MTT 還原)。還原生成的 formazan 結晶可在含 50% 的 N,N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解,利用酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值,以反映出活細胞數目。也可以用 DMSO 來(lái)溶解。
MTT 粉末和溶液保存時(shí)都需要避光,用鋁箔紙包好就可以。
試劑、試劑盒
10% 胎小牛血清 MTT 溶液 DMSO
儀器、耗材
96 孔板 離心機 酶聯(lián)免疫 監測儀
實(shí)驗步驟
步驟
1、接種細胞
用含 10% 胎小牛血清得培養液配成單個(gè)細胞懸液,以每孔 1000-10000 個(gè)細胞接種到 96 孔板,每孔體積 200ul。
2、培養細胞
同一般培養條件,培養 3-5 天(可根據試驗目的和要求決定培養時(shí)間)。
3、呈色
培養 3-5 天后,每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 配)20ul. 繼續孵育 4 小時(shí),終止培養,小心吸棄孔內培養上清液,對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO,振蕩 10 分鐘,使結晶物充分融解。
4、比色
選擇 490nm 波長(cháng),在酶聯(lián)免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時(shí)間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。
注意事項
1、選擇適當得細胞接種濃度。
2、避免血清干擾:一般選小于 10% 的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。
3、設空白對照:與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致,最后比色以空白調零。
MTT 實(shí)驗吸光度最后要在 0-0.7 之間,超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系,
IC50 是半抑制率,意思是抑制率 50% 的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度,然后計算各自的抑制率,以藥品的濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,然后得到 50% 抑制率時(shí)候的藥品濃度,就是 IC50。要點(diǎn):藥品 2 倍稀釋?zhuān)嘧鎏荻?,做點(diǎn)線(xiàn)圖即可!