實(shí)驗方法原理

     MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT 噻唑藍為基礎。MTT 為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線(xiàn)粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下 tetrazolium 環(huán)開(kāi)裂，生成藍色的 formazan 結晶，formazan 結晶的生成量?jì)H與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。還原生成的 formazan 結晶可在含 50% 的 N，N-二甲基甲酰胺和 20% 的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的 MTT 溶解液中溶解，利用酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值，以反映出活細胞數目。也可以用 DMSO 來(lái)溶解。

     MTT 粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。

     試劑、試劑盒

     10% 胎小牛血清   MTT 溶液   DMSO

     儀器、耗材

     96 孔板   離心機   酶聯(lián)免疫   監測儀

     實(shí)驗步驟

     步驟

     1、接種細胞

      用含 10% 胎小牛血清得培養液配成單個(gè)細胞懸液，以每孔 1000－10000 個(gè)細胞接種到 96 孔板，每孔體積 200ul。

     2、培養細胞

     同一般培養條件，培養 3－5 天（可根據試驗目的和要求決定培養時(shí)間）。

     3、呈色

     培養 3－5 天后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/ml 用 PBS 配）20ul. 繼續孵育 4 小時(shí)，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO，振蕩 10 分鐘，使結晶物充分融解。

     4、比色

     選擇 490nm 波長(cháng)，在酶聯(lián)免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時(shí)間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。

     注意事項

     1、選擇適當得細胞接種濃度。

     2、避免血清干擾：一般選小于 10% 的胎牛血清的培養液進(jìn)行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內殘余培養液。

     3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最后比色以空白調零。

     MTT 實(shí)驗吸光度最后要在 0-0.7 之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系，

     IC50 是半抑制率，意思是抑制率 50％ 的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到 50％ 抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是 IC50。要點(diǎn)：藥品 2 倍稀釋?zhuān)嘧鎏荻?，做點(diǎn)線(xiàn)圖即可！