一、目的

     本實(shí)驗的目的是學(xué)會(huì )cDNA芯片的使用方法。了解各種基因芯片的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。

     基因芯片這一技術(shù)方法在1991年的Science雜志上被首次提出，其高通量、并行檢測的特點(diǎn)適應了分析人類(lèi)基因組計劃所提供的海量的基因序列信息的需要，可以說(shuō)，人類(lèi)基因組計劃是基因芯片技術(shù)發(fā)展的原因，而對深人研究基因突變和基因表達的有效方法的需求又是促進(jìn)基因芯片技術(shù)發(fā)展的動(dòng)力。
 
     由于基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點(diǎn)，基誕生以來(lái)就受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，正如晶體管電路向集成電路發(fā)展的經(jīng)歷一樣，分子生物學(xué)技術(shù)的集成化正在使生命科學(xué)的研究和應用發(fā)生一場(chǎng)革命。
 
     根據固定在芯片載體上的核酸分子的不同，基因芯片可以分為cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。寡核昔酸芯片主要基于光引導聚合技術(shù)，該技術(shù)是Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的專(zhuān)利技術(shù)，由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應用。

     二、原理

     基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱(chēng)DNA微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內的千萬(wàn)個(gè)核酸分子所組成的微點(diǎn)陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來(lái)自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標記，在專(zhuān)用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。
 
     基因芯片技術(shù)主要包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結果分析。

     1、芯片制備-目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。芯片的制備除了用到微加工工藝外，還需要使用機器人技術(shù)。以便能快速、準確地將探針?lè )胖玫叫酒系闹付ㄎ恢谩?/span>
 
     2、樣品制備-生物樣品往往是復雜的生物分子混合體，除少數特殊樣品外，一般不能直接與芯片反應，有時(shí)樣品的量很小。所以，必須將樣品進(jìn)行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。

     3、雜交反應-雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進(jìn)行的反應產(chǎn)生一系列信息的過(guò)程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處于最佳狀況中，減少生物分子之間的錯配率。
 
     4、信號檢測和結果分析-雜交反應后的芯片上各個(gè)反應點(diǎn)的熒光位置、熒光強弱經(jīng)過(guò)芯片掃描儀和相關(guān)軟件可以分析圖像，將熒光轉換成數據，即可以獲得有關(guān)生物信息。
 
     目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片兩大類(lèi)組成。以下分別介紹這兩類(lèi)芯片的基本原理和特點(diǎn)：

     寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)

     概念：是指做在固相載體上的寡核苷酸微陣列。其制備方法以直接在基片上進(jìn)行原位合成為主、有時(shí)也可以預先合成，再按照制備cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法，有幾種不同的工藝，其中最著(zhù)名的是美國Affymetrix公司的專(zhuān)利技術(shù)——光引導化學(xué)合成法(Light-directed chemical synthesis process)。產(chǎn)品名為GeneChip。

     Affymetrix公司已公開(kāi)的光引導化學(xué)合成主要過(guò)程如下：首先根據雜交目的確定寡核昔酸探針的長(cháng)度和序列。再由計算機設計出合成寡核苷酸時(shí)用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探針合成。光導原位合成技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列，探針陣列密度可高達到每平方厘米一百萬(wàn)個(gè)。而這種方法的主要缺點(diǎn)：一是需要預先設計、制造一系列掩模，造價(jià)較高：二是每步產(chǎn)宰較低．因此合成探針的長(cháng)度受到了限制。

     此外，原值合成的方法還有Incyte Phamaceuticals5公司(http//www.incyte.com)和Rosetta Biosystem Inc公司等使用的基于噴墨打印原理的原價(jià)合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by ink-jet printer devices)。噴印裝置與普通的彩色噴墨打印機類(lèi)似，用四種堿基液體取代墨盒中的彩色墨汁，通過(guò)計算機控制噴印機將特定種類(lèi)的試劑噴灑到預定的區域上。沖洗、去保護、偶聯(lián)等過(guò)程與傳統的DNA固相原值合成技術(shù)相同。噴印法可以合成長(cháng)度為40~50 nt的寡核昔酸鏈，每步產(chǎn)率可以達到99％，合成30nt的寡核昔酸產(chǎn)率可達70％以上。日本佳能公司利用其獨創(chuàng )的“氣泡噴墨”技術(shù)，僅用24 pl溶液就可以在基片上制作出近百微米的小探針點(diǎn)．每平方厘米可排布近20000個(gè)探針，克服了噴墨打印技術(shù)制備探針陣列密度較小的缺點(diǎn)。

     寡核昔酸芯片的雜交和檢測分析：樣品處理和雜交檢測方法與cDNA芯片是一致的。由于寡核昔酸陣列多需要區分單堿基突變．因此嚴格控制雜交液鹽離子濃度、雜交溫度和沖洗時(shí)間是雜交實(shí)驗成敗的關(guān)鍵。

     cDNA芯片（cDNA Chip）

     概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上固定的成千上萬(wàn)個(gè)cDNA分子組成cD4A微陣列。制作cDNA芯片最常用的固相載體是顯微鏡載玻片，載玻片在使用前需要進(jìn)行表面處理，目的是抑制玻璃片表面對核酸分子的非特異性吸附作用。常用的表面處理方法有氨基化法、醛基化法和多聚賴(lài)氨酸包被法。

     cDNA芯片的制備：制備cDNA芯片多用合成后點(diǎn)樣法(Spotting after synthesis)，簡(jiǎn)稱(chēng)點(diǎn)樣法。合成后點(diǎn)樣法使用的專(zhuān)用設備稱(chēng)為點(diǎn)樣儀(Arrayer)，目前有多家國外公司(如Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic Microsystems,Genomicssolutions等)生產(chǎn)點(diǎn)樣儀。點(diǎn)樣儀的主要部件是由計算機系統控制的電腦機械手。點(diǎn)樣時(shí)電腦機械手利用點(diǎn)樣針頭(Pin)從96或384檄孔板上蘸取cDNA樣品，按照設計好的位置點(diǎn)在載玻片表面。針頭的數目、機械手的移動(dòng)時(shí)間、針頭清洗和干燥時(shí)間、樣品總數和載破片數目共同決定了點(diǎn)樣所需時(shí)間；針頭的直徑和形狀、樣品溶液的粘滯程度以及固相載體的表面特性決定了芯片上液滴的量和擴散面積。

     除點(diǎn)樣法以外，cDNA芯片也可以用電子定位法(Electronic addressing)制備。美國Nanogen公司最早使用這項技術(shù)，他們對空白片上的持定位點(diǎn)進(jìn)行電活化，使相應活化點(diǎn)的表面帶有電荷，成為“微電極”，能夠吸附cDNA分子。帶有微電極的片子與樣品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附的微電極上，并與片子表面發(fā)生化學(xué)結合從而固定。用這種工藝制備的芯片的優(yōu)點(diǎn)是：微電極的電吸附作用可以提高與靶核酸的雜交效率。缺點(diǎn)是制備復雜．成本較高。這種帶有微電極的芯片也稱(chēng)為主動(dòng)式芯片。許多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根據需要從公司定制。美國Incyte公司是顯著(zhù)名的cDNA芯片提供商之—，其產(chǎn)名為GEMTM芯片，每張片子上最多可以含有10000點(diǎn)，對樣品中mRNA的檢出限達到2pg，對兩種來(lái)源樣品中的基因差異表達的檢出限為2倍。

     cDNA芯片的使用方法——樣品制備和雜交

     樣品制備包括分離和標記兩個(gè)方面，有些樣品還嬰經(jīng)過(guò)核酸擴增放大這一步驟。樣品制備的一般過(guò)程是：提取待檢樣品中的mRNA，反轉錄成cDNA，同時(shí)標記上熒光(熒光標記為最常用的方法．優(yōu)點(diǎn)是無(wú)放射性且有多種顏色可供使用；研究者可以根據需要選用其它標記方法，例如同位素標記法、化學(xué)發(fā)光法或酶標法；如果目的是研究?jì)煞N來(lái)源的組織細胞基因的差異表達，則分別提取兩種組織細胞的mRNA，反轉錄成cDNA，分別標記兩種不同顏色的熒光(如Cy3和Cy5)，等量混合后與芯片進(jìn)行雜交反應。

雜交信號檢測和分析

     通常檢測芯片上的雜交信號需要高靈敏度的檢測系統——閱讀儀(Reader)，閱讀儀的成像原理分為激光共焦掃描和CCD成像兩種。前者分辨率和靈敏度較高，但是掃描速度較慢且價(jià)格昂貴。后者的持點(diǎn)與之相反。十祈一次標準的cDNA芯片雜交實(shí)驗產(chǎn)生的成干上萬(wàn)個(gè)點(diǎn)的雜交信息，需要生物信息學(xué)手段的支持。已經(jīng)有多種讀取和分析雜交信號的應用軟件以及能夠與網(wǎng)絡(luò )公共數據庫連接進(jìn)行數據分析的應用軟件、在NHGRI的問(wèn)站可以下載用于圖像分析的軟件，還可以找到能夠與Genbank、Unigene等數據庫聯(lián)機工作的軟件包。