1 樣品RNA的抽提

 

      ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解.

 

      ②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%

 

      ③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

 

     ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

 

     ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

 

     ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

 

     2 RNA質(zhì)量檢測

 

     1）紫外吸收法測定

 

     先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?/span>1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

 

     ① 濃度測定

 

     A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 ?g/ml。具體計算如下：

 

     RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中，測得A260 = 0.21

 

     RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l

 

     取5ul用來(lái)測量以后，剩余樣品RNA為35 ?l，剩余RNA總量為：

 

     35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g

 

     ②純度檢測

 

     RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

 

     2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

 

     ①制膠

 

     1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

 

     10×MOPS電泳緩沖液

 

      濃度  成分

 

     0.4M  MOPS，pH 7.0

 

     0.1M  乙酸鈉

 

     0.01M  EDTA

 

     灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

 

     ②準備RNA樣品

 

     取3?gRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

 

     ③電泳

 

     上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。

 

     ④紫外透射光下觀(guān)察并拍照

 

     28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現DNA污染，將會(huì )在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

 

     3 樣品cDNA合成

 

     ①反應體系

 

     序號  反應物  劑量

 

     1  逆轉錄buffer  2μl 

 

      2  上游引物  0.2μl

 

     3  下游引物  0.2μl

 

     4  dNTP  0.1μl

 

     5  逆轉錄酶MMLV  0.5μl

 

     6  DEPC水  5μl

 

     7  RNA模版  2μl

 

     8  總體積  10μl

 

     輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

 

     ②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

 

     ③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

 

     4 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR

 

     ①β-actin陽(yáng)性模板的標準梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋?zhuān)铀?/span>27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

 

     ②反應體系如下：

 

     標準品反應體系

 

     序號  反應物  劑量

 

     1   SYBR Green 1 染料  10μl

 

     2  陽(yáng)性模板上游引物F  0.5μl

 

     3  陽(yáng)性模板下游引物R  0.5μl

 

     4  dNTP  0.5μl

 

     5  Taq酶  1μl

 

     6  陽(yáng)性模板DNA  5μl

 

     7  ddH2O  32.5μl

 

     8  總體積  50μl

 

     輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。