超濾主要采用多孔材料，在壓力驅動(dòng)下將物質(zhì)進(jìn)行膜分離的過(guò)程，這種多孔材料成為超濾膜，那么影響蛋白超濾實(shí)驗的主要因素有哪些呢？使用超濾膜處理蛋白有哪些注意事項呢？

     蛋白超濾實(shí)驗的影響因素

     蛋白超濾實(shí)驗中，主要會(huì )受到哪些因素的影響?超濾透過(guò)通量的影響因素如下：

     1. 料液流速

     提高料液流速雖然對減輕濃差極化、提高透過(guò)通量有利，但需要提高料液壓力，增加耗能。一般紊流體系中流速控制在1-3m/s。

     2. 操作壓力

     超濾膜透過(guò)通量與操作壓力的關(guān)系取決于膜和凝膠層的性質(zhì)。超濾過(guò)程為凝膠化模型，膜透過(guò)通量與壓力無(wú)關(guān)，這時(shí)的通量成為臨界透過(guò)通量。實(shí)際操作壓力應在極限通量附近進(jìn)行，  此時(shí)的操作壓力約為0.5-0.6Mpa。

     超濾過(guò)程中只有當工作壓力達到一定程度，才能使液料中的小分子 透膜分離。工作壓力太小時(shí)，濾液的產(chǎn)量小，不能滿(mǎn)足正常的生產(chǎn)。而工作壓力太大時(shí)，會(huì )增加極化層的厚度，抵消增壓的增速效果，同時(shí)也會(huì )把沉積在膜上的沉積層壓實(shí)，難以被沖刷，膜孔很快被堵塞，影響超濾效果，此外，每一種超濾膜均有其耐壓范圍，使用時(shí)應在這個(gè)范圍內進(jìn)行。

     3. 溫度

     操作溫度主要取決于所處理的物料的化學(xué)、物理性質(zhì)。由于高溫可降低料液的黏度，增加傳質(zhì)效率，提高透過(guò)通量，因此應在允許的最高溫度下操作。

     溫度升高時(shí)可部分克服分子 間的作用力，降低粘度。同時(shí)也影響膜的工作性能，增加通透性。溫度過(guò)高也會(huì )影響超濾膜的壽命。

     4. 運行周期

     隨著(zhù)超濾過(guò)程的進(jìn)行，在膜表面逐漸形成凝膠層，使透過(guò)通量下降，當通量達到某一最低數值時(shí)，就需要進(jìn)行沖洗，這段時(shí)間成為運行周期。運行周期的變化與清洗情況有關(guān)。

     5. 進(jìn)料濃度

     隨著(zhù)超濾過(guò)程的進(jìn)行。主題液流的濃度逐漸增加。此時(shí)黏度變大，使凝膠層厚度增加，從而影響透過(guò)通量。因此對主體液流應定出最高允許濃度。

     料液濃度直接影響濾速。超濾的通量與濃度的對數呈直線(xiàn)關(guān)系。一般來(lái)講，隨著(zhù)料液濃度的增高，料液的粘度會(huì )升高，超濾時(shí)形成極化層的時(shí)間會(huì )縮短，從而使超濾的速度降低、效率也降低。因此在超濾時(shí)應注意控制料液的濃度，

     6. 料液的預處理

     為了提高膜的透過(guò)通量，保證超濾膜的正常穩定運行，根據需要應對料液 進(jìn)行預處理。 預處理效果好壞，直接影響超濾膜的污染程度，系統的生產(chǎn)能力以及超濾膜的使用壽命。預處理一般采用高速離心法、微濾法、調PH值、熱處理、冷藏法或多種方法組合進(jìn)行。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的絮凝劑法可去除提取液中的鞣質(zhì)、色素、果膠等有機大分子不穩定物質(zhì)。

     7. 膜的清洗

     膜必須進(jìn)行定期沖洗，以保持一定的透過(guò)量，并能延長(cháng)膜的使壽命。一般在規定的料液和壓力下，在允許的pH值范圍內，溫度不超過(guò)60。C時(shí)，超濾膜可使用12-18個(gè)月。如膜清洗不佳，回使膜的壽命縮短。

     8. 超濾膜孔徑大小

     超濾膜孔徑大小的選擇應與藥液中目標成分的大小相一致?？讖竭^(guò)大，則分離效果不好，雜質(zhì)含量過(guò)高，影響澄明度和穩定性?？讖竭^(guò)小，有效成分通透率較低，損失較大。

     9. 洗脫量

     蛋白超濾膜的使用問(wèn)題

     洗脫量的多少影響濾液中目標成分的含量。洗脫量太少，則留在濃縮液中的目標成分會(huì )較多，損失較大;洗脫量太大時(shí)，雖然回收率增加，但有可能需要后處理或使原有的后處理工序時(shí)間延長(cháng)，應注意協(xié)調它們之間的關(guān)系。

     (一)問(wèn)題：超濾膜處理蛋白時(shí)，使用前應該做哪些處理呢?

     1. 使用后應將超濾膜用0.2MNaOH處理30分鐘，然后用水清洗之中性，最后保存在20%的乙醇中。

     2. 根據使用的超濾膜的性質(zhì)(穩定性)，一般情況建議用0.1~0.5M NAOH,進(jìn)行30分鐘以上的清洗，在使用前后通過(guò)測試膜的水通量評估膜的透過(guò)性能和清洗效果。為了減少蛋白的損失，建議濃縮前用緩沖液潤洗膜，濃縮后用緩沖液沖洗膜回收蛋白。并且保存膜的條件也要根據膜性質(zhì)選擇合適的條件。

     (二)問(wèn)題：雖然知道是一次性的，但實(shí)驗室的Millipore 超濾還是久經(jīng)考驗，用了又用。但最近超濾一個(gè)懸濁液，不慎把膜堵了，請教高手有沒(méi)有在不損傷膜的前提下把堵膜的物質(zhì)洗下來(lái)。(改物質(zhì)可能是一些蛋白沉淀)

     1. 如果堵得比較厲害，還可以在NaOH溶液中加點(diǎn)NaClO效果會(huì )更好，洗膜的時(shí)候最好用熱的溶液。

     2. 我用一個(gè)管子提一種蛋白的不同溶液，純化后的分部收集管子.如果保養的好可以用很多次.一般不用時(shí)候放在乙醇中，放置染菌.　另外，容易出問(wèn)題的環(huán)節主要有　濾膜破裂，套管破裂，濾膜堵塞等.我最近碰到的問(wèn)題就是堵塞.樓上的方法不錯，今天試用過(guò)了.另外，需要提醒你的是：濾膜過(guò)濾后，附著(zhù)在膜上的蛋白量比較大，也就是說(shuō)，體積的變化倍數和濃縮倍數是不一樣的

     3. 可以使用 0.1-0.5 M NAOH清洗

     (三)問(wèn)題：在使用之后，用水和1N NAOH 清洗完后，測得水通量也沒(méi)問(wèn)題。但是在把膜包從夾具拿出來(lái)準備 保存的時(shí)候 ，發(fā)現膜包邊上的 小孔仍然有很多 可見(jiàn)雜質(zhì)。

     (四)問(wèn)題：我的蛋白14kD，用截流10000的怎么一點(diǎn)都離不下。而且在我只加超純水時(shí)，水也離不下，十分迷惑

     你是用超濾離心管嗎?水都離心不下，不是離心力不夠吧，要不膜用別的什么處理過(guò)了變疏水的了。還是選錯了型號。

     (五)問(wèn)題：請問(wèn)millipore的超濾管可以反復使用嗎? 如果可以的話(huà),第一次使用后該如何處理呢?

     為避免交叉污染，同種蛋白我想可以重復使用。

     millipore的膜，您選擇的是什么材質(zhì)。

     如果是PES材質(zhì)，那么用后可以用0.5M NaOH浸泡，這樣水通量可能會(huì )保持的久一點(diǎn)。

     (六)問(wèn)題：目前我公司也在用millpore得超濾系統以及超濾管，也存在一些問(wèn)題想咨詢(xún)一下。超濾管在使用過(guò)以后應該如何維護才能延長(cháng)使用壽命保證超濾效果?

 

     超濾管一般是一次性使用的，有些時(shí)候可以反復用幾次，就當白賺了。

     一定要談維護的話(huà)，在材質(zhì)允許的情況下，如PES的膜，用畢可以用0.1-0.5M NaOH浸泡，有可能多用幾次。

     具體millipore的材質(zhì)，需要和millipore咨詢(xún)

     (七)問(wèn)題：請問(wèn)如何選定超濾膜的孔徑大小?如果我選擇30kd得超濾管，那么我得到的目標蛋白應該在什么范圍之內?

     那很難說(shuō)，不同公司的膜孔徑標稱(chēng)是存在明顯差異的，沒(méi)有通用標準。

     而且，某個(gè)蛋白的具體的截留狀況和蛋白的濃度、構象、buffer種類(lèi)、壓力、膜材質(zhì)、是否濾洗等密切相關(guān)。

     只能說(shuō)，如果希望100%截留某個(gè)蛋白，一般膜孔徑選擇為目標蛋白的1/3-1/5。

     (八)問(wèn)題：用10KD，15ml的超濾管超濾含20KD目的蛋白的蛋白溶液，會(huì )不會(huì )有目的蛋白穿過(guò)濾膜呢，我同學(xué)用這個(gè)超濾管超濾17KD的蛋白液，竟然有目的蛋白透過(guò)濾膜

     可能會(huì )有一定的透過(guò)損失，因為截留和分子的形狀也有關(guān)系。

     為了100%截留, 超濾膜的截留分子量最好是目的蛋白的1/3比較保險

     (九)問(wèn)題：我們公司需要的是通過(guò)超濾管的那部分液體，將我們的產(chǎn)品分離，我說(shuō)的超濾液就是指離心以后，透過(guò)濾膜進(jìn)入一次性試管中的那部分液體，而不是殘留在超濾管中的那部分液體。我們的目標液體就是離心出來(lái)的那部分液體，我想知道的是，30kd的濾膜截留的應該是30000以上的蛋白質(zhì)分子吧，30000一下的蛋白分子是不是就隨著(zhù)離心作用流入試管中了。

     濾膜的孔徑并不像你想象的那樣是完全均一的，事實(shí)上，膜的孔徑是一個(gè)范圍。膜分離的分辨率并不像你想象的那么高。只有分子量相差10倍以上的兩種分子，才有可能使用膜分離技術(shù)加以分離。