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凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗


     凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關(guān)的DNA結合序列相互作用的技術(shù),可用于定性和定量分析。通常將純化的蛋白或細胞粗提液和標記的DNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電涌上,分離復合物和非結合的探針,DNA-復合物比非結合的探針移動(dòng)慢。常用實(shí)驗手段有同位素32P法和非同位素法(化學(xué)發(fā)光法)。標記探針根據研究結合蛋白的不同,可以是雙鏈或是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類(lèi)的DNA結合蛋白,可以純化蛋白,粗蛋白或核細胞抽提液。競爭實(shí)驗中采用含蛋白結合序列的DNA片段和寡聚糖核苷酸片段(特異)和其他非相關(guān)的片段(非特異性)來(lái)確定DNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異性和非特異性片段的存在下,依據復合物的特點(diǎn)和強度來(lái)確定特異性結合。

實(shí)驗步驟:


    1.探針的標記探針為含有與蛋白特異性結合的中心盒,大約20bp。


    2.非變性電泳


 (1)制備4%非變性膠


 (2)制備樣品


 (3)電泳:預跑膠30-60min,100V,上樣,跑膠,100V,30min左右


    3.轉膜:將膠取下,放在大小相似的尼龍膜上,上下各加1層潤濕的blotting paper , 放到半干轉移裝置上,100V,380mA , 轉膜1H.


    4.紫外交聯(lián): 取出膜,在紫外交聯(lián)儀中交聯(lián),999.9mJ,固定10min。


    5.洗膜



實(shí)驗步驟:

 (1)將封閉液和4倍洗滌液置于37-50℃溶解。


 (2)用20ml封閉液封閉尼龍膜,溫浴15min,搖船輕搖。


 (3)20ml封閉液中加入66.7ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀釋),配制成conjugate/blocking solution。


 (4)將膜從封閉液中取出,在conjugate/blocking solution中輕搖15min。


 (5)將4倍洗滌液用雙蒸水稀釋成1倍洗滌液。


 (6)將膜置于新的培養皿,用20ml1倍洗滌液沖洗。


 (7)用1倍洗滌液洗膜4次,每次5min,搖床輕搖。


 (8)在新培養皿中加入30ml Substrate Equilibration Buffer,將膜放入,溫浴5min,搖床輕搖。


 (9)加入6mlLuminol/Enhancer Solution 和6ml Stable Peroxide Solution, 避光置于錫箔紙包好的燒杯中,搖勻,作為Substrate Working Solution。


 (10)將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出,用濾紙盡量吸去液體,放入新的培養皿。


 (11)將Substrate Working Solution用槍慢慢加到膜上使液體盡量到達整張膜,靜置5min。


 (12)取出膜,控制膜不能干燥。


 (13)用保鮮膜將膜包好,不能有氣泡。


 (14)在暗室中,將膜放入曝光盒,用X-ray膠片壓片,曝光。


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