1.探針的標記探針為含有與蛋白特異性結合的中心盒,大約20bp。
2.非變性電泳
(1)制備4%非變性膠
(2)制備樣品
(3)電泳:預跑膠30-60min,100V,上樣,跑膠,100V,30min左右
3.轉膜:將膠取下,放在大小相似的尼龍膜上,上下各加1層潤濕的blotting paper , 放到半干轉移裝置上,100V,380mA , 轉膜1H.
4.紫外交聯(lián): 取出膜,在紫外交聯(lián)儀中交聯(lián),999.9mJ,固定10min。
5.洗膜
(1)將封閉液和4倍洗滌液置于37-50℃溶解。
(2)用20ml封閉液封閉尼龍膜,溫浴15min,搖船輕搖。
(3)20ml封閉液中加入66.7ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀釋),配制成conjugate/blocking solution。
(4)將膜從封閉液中取出,在conjugate/blocking solution中輕搖15min。
(5)將4倍洗滌液用雙蒸水稀釋成1倍洗滌液。
(6)將膜置于新的培養皿,用20ml1倍洗滌液沖洗。
(7)用1倍洗滌液洗膜4次,每次5min,搖床輕搖。
(8)在新培養皿中加入30ml Substrate Equilibration Buffer,將膜放入,溫浴5min,搖床輕搖。
(9)加入6mlLuminol/Enhancer Solution 和6ml Stable Peroxide Solution, 避光置于錫箔紙包好的燒杯中,搖勻,作為Substrate Working Solution。
(10)將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出,用濾紙盡量吸去液體,放入新的培養皿。
(11)將Substrate Working Solution用槍慢慢加到膜上使液體盡量到達整張膜,靜置5min。
(12)取出膜,控制膜不能干燥。
(13)用保鮮膜將膜包好,不能有氣泡。
(14)在暗室中,將膜放入曝光盒,用X-ray膠片壓片,曝光。