染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，簡(jiǎn)稱(chēng)ChIP)是研究體內蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種技術(shù)。它利用抗原抗體反應的特異性，可以真實(shí)地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。特別是近年來(lái)由于該技術(shù)不斷的發(fā)展和完善，其應用范圍已經(jīng)從研究目的蛋白與已知靶序列間的相互作用，發(fā)展到研究目的蛋白與整個(gè)基因組的未知序列的相互作用;從研究一個(gè)目的蛋白與DNA的相互作用，發(fā)展到研究?jì)蓚€(gè)蛋白與DNA共同結合的相互作用;從研究啟動(dòng)子區域的組蛋白的修飾，發(fā)展到研究結合在DNA序列上的蛋白復合物。隨著(zhù)對基因功能研究的不斷深入，這項技術(shù)正越來(lái)越多的被應用于科研的各個(gè)領(lǐng)域。

chip技術(shù)的原理  

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理

    在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來(lái)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因為ChIP實(shí)驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實(shí)驗過(guò)程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經(jīng)驗。對于剛剛開(kāi)始使用ChIP技術(shù)的研究人員來(lái)說(shuō)，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會(huì )達到事半功倍的效果，比如millipore公司的EZ-ChIP試劑盒就是專(zhuān)門(mén)為初學(xué)者設計的入門(mén)產(chǎn)品。下面我們就最基本的實(shí)驗步驟，實(shí)驗中的小技巧以及需要注意的問(wèn)題簡(jiǎn)單介紹一下。

    1. 細胞固定  甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯(lián)反應是完全可逆的，便于在后續步驟中對DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據實(shí)驗而定。值得注意的是，交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)長(cháng)，細胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實(shí)驗材料也容易在離心過(guò)程中丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性。甲醛的交聯(lián)反應可被加入的甘氨酸終止。

染色質(zhì)免疫沉淀中的對照與抗體選擇Input對照

    在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實(shí)驗必不可少的步驟。

Beads選擇

    接下來(lái)，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。Magna beads是近年來(lái)出現的一種新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過(guò)程中更簡(jiǎn)單，而且免去了離心的步驟，節省不少時(shí)間。

染色質(zhì)免疫沉淀中的對照與抗體選擇

    染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗成功的關(guān)鍵。因為在蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結合時(shí)，抗體的抗原表位可能因為與結合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實(shí)驗的，只有經(jīng)過(guò)ChIP實(shí)驗驗證后的抗體才能確保實(shí)驗結果的可靠性。

陽(yáng)性與陰性對照

    在做ChIP實(shí)驗時(shí)，一定要做好實(shí)驗對照，因為沒(méi)有對照，很難對實(shí)驗結果的可靠性進(jìn)行評估。陽(yáng)性抗體和陰性抗體對照是最基本的實(shí)驗對照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會(huì )選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會(huì )結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。最佳的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結合的序列。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀(Immunoprecipitation)檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗的檢測。

染色質(zhì)免疫沉淀中的對照與抗體選擇交聯(lián)反應的逆轉和DNA的純化

    用不含DNase的RNase和Proteinase K，65oC保溫6小時(shí)逆轉交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質(zhì)量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。因為甲醛不僅交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)，還交聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，所以還可以對DNA序列上的蛋白質(zhì)復合物進(jìn)行分析。在逆轉交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。  

DNA的鑒定

    最常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動(dòng)子區域的序列具有多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細胞系或不同的動(dòng)物品系的同一基因的啟動(dòng)子序列有可能不同。而且啟動(dòng)子區域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應調整。有條件可設計不止一對引物來(lái)反復驗證ChIP實(shí)驗的結果。

ChIP技術(shù)的應用  

    染色質(zhì)免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可采用狹縫雜交(Slot blot)的方法，把靶序列特異性探針與染色質(zhì)免疫沉淀的DNA雜交，來(lái)驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進(jìn)行測定，或采用Real-time PCR方法進(jìn)行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput)，可采用Southern雜交。但因為免疫沉淀的DNA量較少，所以在研究時(shí)通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進(jìn)行整個(gè)基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進(jìn)行測序，尋找該序列附近的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現新的基因調節序列。

    目前，隨著(zhù)人類(lèi)基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個(gè)基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。由于基因組中的信息量非常大，上述常規方法通常無(wú)法滿(mǎn)足科研的需要。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的ChIP-chip技術(shù)將基因組DNA芯片(chip)技術(shù)與染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)相結合，為研究目的蛋白與整個(gè)基因組相互作用提供了可能。ChIP-chip 技術(shù)通過(guò)標記染色質(zhì)免疫沉淀富集的DNA片段，和另一個(gè)被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA芯片雜交，再利用各種生物信息學(xué)方法對收集到的信號進(jìn)行分析，具體的實(shí)驗步驟請參考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于研究轉錄因子在整個(gè)基因組中的信號網(wǎng)絡(luò )染色質(zhì)修飾機制在基因組中的調控，DNA的復制，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。

    染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)還可用于分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基礎上不解交聯(lián)，而繼續進(jìn)行另一個(gè)目的蛋白的免疫沉淀，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。值得注意的是，因為通過(guò)兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少，所以在分析時(shí)通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進(jìn)行操作。