蛋白印跡(Western blot, WB)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種試驗方法,是將蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE電泳后,再轉移到雜交膜上,然后通過(guò)抗原抗體復合物對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性檢測的方法。
一、檢測原理
待測蛋白根據其性質(zhì)(分子量、分子大小、電荷以及其等電點(diǎn))采用電泳方法進(jìn)行分離,通過(guò)電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,利用一抗與抗原特異性結合的原理,以抗體作為探針釣取目的蛋白。
二、 樣品處理及上樣
* 上樣總體積一般少于15ul,加樣孔的最大限度可加20ul樣品。
2、95℃孵育5min,使蛋白變性。
3、電泳槽內加入足夠的電泳液。
*樣品吸出時(shí)不要吸進(jìn)氣泡。加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出,加下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器槍頭需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,一面交叉污染,有條件最好加樣時(shí)一個(gè)樣品換一個(gè)槍頭。
三、 電泳
電泳條件:電壓200V,電流8mA,染料進(jìn)入分離膠時(shí)電流增加到16mA,時(shí)間一般2-3小時(shí)。
*溴酚藍剛跑出膠即可終止電泳進(jìn)行轉膜,也可以根據時(shí)間經(jīng)驗停止電泳。
*電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均,可采用銅染色或考馬斯亮藍染色檢測,如凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉膜則需要可逆的銅染法,否則采用不可逆考馬斯亮藍法。
*銅染色法:
電泳膠用蒸餾水洗數秒鐘 加入0.3mol/LCuCl2染色5-10min 去離子水洗一次 暗室觀(guān)察藍色背景下出現的蛋白透明條帶 膠置于0.1-0.25mol/L Tris/0.25mol/L EDTA(PH 8.0)緩沖液中漂洗脫色兩次 電轉緩沖液中轉膜。
四、 轉膜
操作步驟:
1、 準備:切好的PVDF膜和濾紙置于甲醇5min,PVDF膜置于電轉緩沖液浸泡10min以上。
*轉一張膜需6張6cm×9cm濾紙和1張6cm×9cmPVDF膜,濾紙和膜的尺寸不能小余膠的尺寸,否則導致電流不能通過(guò)膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因手上的蛋白會(huì )污染膜。
2、 加有轉膜液搪瓷盤(pán)中放入轉膜用的已浸過(guò)的PVDF膜和濾紙。
3、 電泳結束后撬掉玻璃板取膠,除去小玻璃板,輕輕刮去濃縮膠。
4 、小心剝下分離膠蓋于已泡好的濾紙上。
5 、200V電壓,160mA穩流電,轉膜1h。
6 、轉完后將膜和濾紙扔掉,PVDF膜右上角用剪子切斷一小部分進(jìn)行標記,Marker用紅藍鉛筆進(jìn)行標記。
7、 PVDF膜放入PBS-T溶液,振蕩5min×3次。
五、 抗原-抗體反應
1 、儀器和設備
塑料盒、振蕩器。
2、 封閉
一般采用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉,室溫,30-60min。
*封閉液的濃度可以是(1%-5%),根據自己的條件摸索濃度就可以。
封閉液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。
3 、一抗的處理
(1)一抗稀釋倍數:根據樣本和抗體的種類(lèi)不同,預實(shí)驗尋找選擇最適稀釋倍數。
(2)一抗孵育時(shí)間:一抗的孵育時(shí)間是從幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜不等,建議使用較高較高的稀釋倍數和較長(cháng)的孵育時(shí)間來(lái)保證特異性結合。一抗過(guò)高會(huì )產(chǎn)生非特異性條帶。
(3)一抗孵育時(shí)間:盡可能低溫孵育,特別是磷酸化一抗過(guò)夜時(shí)應在4℃進(jìn)行,否則會(huì )產(chǎn)生污染而破壞磷酸化蛋白。
*孵育一抗最好在搖床上進(jìn)行,防止結合不均勻。
4 、二抗的處理
(1)常用二抗:HRP偶聯(lián)二抗。也可用堿性磷酸酶標記二抗,但不夠靈敏。
(2)二抗稀釋液:PBS/PBS-T液、TBS/TBS-T液、一般的封閉液等。
(3)二抗稀釋倍數:根據二抗說(shuō)明書(shū)推薦倍數稀釋二抗。也可按1:100-1:20000常規稀釋倍數進(jìn)行預實(shí)驗選擇最適稀釋倍數。如二抗的濃度過(guò)高可導致非特異性條帶。
二抗孵育時(shí)間:一般室溫孵育1h。
5 、實(shí)驗步驟
(1)封閉結束后,用PBS-T液輕輕清洗膜,去除封閉液。
(2)用一抗室溫孵育1h或4℃過(guò)夜。
(3)PBS-T液清洗,10min×3次。
(4)二抗孵育,室溫,1h。
(5)PBS-T液清洗,10min×3次。
(6)用顯色液顯色。
六 、顯色
1、HRP標記二抗
(1)酶促底物發(fā)光法
配方如下:
DABDDW
*現配現用,避光保存。
*顯色前每50ml加入30%過(guò)氧化氫7.5ul。
*敏感性較ECL差。DAB是致癌物質(zhì),配制時(shí)應戴手套。顯色后膜可用DDW清洗,風(fēng)干保存。
2、AP標記二抗
顯色液配置
(1)100×氯化硝基四氮唑藍(NBT):
10ml配方如下:
NBT 0.33g
70%二甲基甲酰胺 10ml
*1.5ml離心管分裝后冷凍保存,可保存數月。
(2)100×溴氯吲哚基磷酸鹽(BCIP):
10ml配方如下:
BCIP 0.165g
100%二甲基甲酰胺 10ml
*難溶時(shí)用10ml蒸餾水,配成50×溶液。分裝冷凍保存,可保存數月。
3.堿性磷酸酶緩沖液:100ml配方如下。
1mol/L Tris-HCL(pH 9.5) 10ml
5mol/L NaCl 2ml
1mol/L MgCl2 0.5ml
DDW 87.5ml
*冷藏保存,可保存數月。
4、顯色液
100BCIP 0.1ml
100×NBT 0.1ml
七、蛋白印跡實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析
1. 沒(méi)有帶?
2.非特異性雜帶