蛋白印跡（Western blot, WB）是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種試驗方法，是將蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE電泳后，再轉移到雜交膜上，然后通過(guò)抗原抗體復合物對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性檢測的方法。

一、檢測原理
    

    待測蛋白根據其性質(zhì)（分子量、分子大小、電荷以及其等電點(diǎn)）采用電泳方法進(jìn)行分離，通過(guò)電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，利用一抗與抗原特異性結合的原理，以抗體作為探針釣取目的蛋白。

二、 樣品處理及上樣

1、取15-20ug蛋白，加2倍SDS上樣緩沖液7ul，DDW定容至總體積14ul。

* 上樣總體積一般少于15ul，加樣孔的最大限度可加20ul樣品。

2、95℃孵育5min，使蛋白變性。

3、電泳槽內加入足夠的電泳液。

4、上樣，分子Marker也要一起上樣，用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，加樣器槍頭插到加樣孔中緩慢加入樣品。

*樣品吸出時(shí)不要吸進(jìn)氣泡。加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出，加下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器槍頭需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，一面交叉污染，有條件最好加樣時(shí)一個(gè)樣品換一個(gè)槍頭。

三、 電泳

電泳條件：電壓200V，電流8mA，染料進(jìn)入分離膠時(shí)電流增加到16mA，時(shí)間一般2-3小時(shí)。

*溴酚藍剛跑出膠即可終止電泳進(jìn)行轉膜，也可以根據時(shí)間經(jīng)驗停止電泳。

*電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染色或考馬斯亮藍染色檢測，如凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉膜則需要可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯亮藍法。

*銅染色法：

    電泳膠用蒸餾水洗數秒鐘    加入0.3mol/LCuCl2染色5-10min    去離子水洗一次     暗室觀(guān)察藍色背景下出現的蛋白透明條帶    膠置于0.1-0.25mol/L Tris/0.25mol/L EDTA(PH 8.0)緩沖液中漂洗脫色兩次    電轉緩沖液中轉膜。

*考馬斯亮藍法：用40%雙蒸水/10%醋酸/50%甲醇的溶液固定膠中蛋白    考馬斯亮藍R-250染色室溫染色4h過(guò)夜，保持搖勻     轉入67.5%雙蒸水/7.5%醋酸/25%甲醇搖勻脫色   蛋白被染成深藍色。

四、 轉膜

    轉膜方式有半干式和濕轉兩種。半干式轉膜速度快，但高分子量蛋白轉膜效果較差。高分子量蛋白質(zhì)與膠相互作用較強，從膠中移出較難。因此，一般大于120-150kDa的蛋白用半干式轉膜時(shí)，可選用堿性電轉緩沖液，也可在電轉緩沖液中加SDS。但SDS妨礙蛋白與膜的結合，尤其對小分子蛋白。濕轉成功率高，特別適用于大分子量（大于100kDa）的蛋白。

操作步驟：

1、 準備：切好的PVDF膜和濾紙置于甲醇5min，PVDF膜置于電轉緩沖液浸泡10min以上。

*轉一張膜需6張6cm×9cm濾紙和1張6cm×9cmPVDF膜，濾紙和膜的尺寸不能小余膠的尺寸，否則導致電流不能通過(guò)膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因手上的蛋白會(huì )污染膜。

2、 加有轉膜液搪瓷盤(pán)中放入轉膜用的已浸過(guò)的PVDF膜和濾紙。

3、 電泳結束后撬掉玻璃板取膠，除去小玻璃板，輕輕刮去濃縮膠。

4 、小心剝下分離膠蓋于已泡好的濾紙上。

5 、200V電壓，160mA穩流電，轉膜1h。

6 、轉完后將膜和濾紙扔掉，PVDF膜右上角用剪子切斷一小部分進(jìn)行標記，Marker用紅藍鉛筆進(jìn)行標記。

7、 PVDF膜放入PBS-T溶液，振蕩5min×3次。

五、 抗原-抗體反應

1 、儀器和設備

塑料盒、振蕩器。

2、 封閉

一般采用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，室溫，30-60min。

*封閉液的濃度可以是（1%-5%），根據自己的條件摸索濃度就可以。

封閉液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。

3 、一抗的處理

（1）一抗稀釋倍數：根據樣本和抗體的種類(lèi)不同，預實(shí)驗尋找選擇最適稀釋倍數。

（2）一抗孵育時(shí)間：一抗的孵育時(shí)間是從幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜不等，建議使用較高較高的稀釋倍數和較長(cháng)的孵育時(shí)間來(lái)保證特異性結合。一抗過(guò)高會(huì )產(chǎn)生非特異性條帶。

（3）一抗孵育時(shí)間：盡可能低溫孵育，特別是磷酸化一抗過(guò)夜時(shí)應在4℃進(jìn)行，否則會(huì )產(chǎn)生污染而破壞磷酸化蛋白。

*孵育一抗最好在搖床上進(jìn)行，防止結合不均勻。

4 、二抗的處理

（1）常用二抗：HRP偶聯(lián)二抗。也可用堿性磷酸酶標記二抗，但不夠靈敏。

（2）二抗稀釋液：PBS/PBS-T液、TBS/TBS-T液、一般的封閉液等。

（3）二抗稀釋倍數：根據二抗說(shuō)明書(shū)推薦倍數稀釋二抗。也可按1：100-1：20000常規稀釋倍數進(jìn)行預實(shí)驗選擇最適稀釋倍數。如二抗的濃度過(guò)高可導致非特異性條帶。

二抗孵育時(shí)間：一般室溫孵育1h。

5 、實(shí)驗步驟

（1）封閉結束后，用PBS-T液輕輕清洗膜，去除封閉液。

（2）用一抗室溫孵育1h或4℃過(guò)夜。

（3）PBS-T液清洗，10min×3次。

（4）二抗孵育，室溫，1h。

（5）PBS-T液清洗，10min×3次。

（6）用顯色液顯色。

六 、顯色

酶和底物反應顯色是蛋白印跡法的最后一步，一般常用酶有HRP和AP，根據成像底物可分為顯色底物和發(fā)光底物。發(fā)光底物可選用HRP標記二抗，顯色底物可選用HRP標記二抗或AP標記二抗。顯色分為酶促底物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光或熒光法。

1、HRP標記二抗

（1）酶促底物發(fā)光法

DAB顯色液配制：50ml

配方如下：

DAB
1mol/L Tri-HCL(pH 7.4)

DDW

*現配現用，避光保存。

*顯色前每50ml加入30%過(guò)氧化氫7.5ul。

*敏感性較ECL差。DAB是致癌物質(zhì)，配制時(shí)應戴手套。顯色后膜可用DDW清洗，風(fēng)干保存。

2、AP標記二抗

顯色液配置

（1）100×氯化硝基四氮唑藍（NBT）：

10ml配方如下：

NBT                   0.33g

70%二甲基甲酰胺       10ml

*1.5ml離心管分裝后冷凍保存，可保存數月。

（2）100×溴氯吲哚基磷酸鹽(BCIP)：

10ml配方如下:

BCIP                  0.165g

100%二甲基甲酰胺      10ml

*難溶時(shí)用10ml蒸餾水，配成50×溶液。分裝冷凍保存，可保存數月。

3.堿性磷酸酶緩沖液：100ml配方如下。

1mol/L Tris-HCL(pH 9.5)                 10ml

5mol/L NaCl                           2ml

1mol/L MgCl2                         0.5ml

DDW                                87.5ml

*冷藏保存，可保存數月。

4、顯色液

100BCIP                              0.1ml

100×NBT                             0.1ml

*顯色后用DDW清洗，風(fēng)干保存。

七、蛋白印跡實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析

1. 沒(méi)有帶？

原因：樣品中抗原含量不足（抗原表達量過(guò)低；蛋白降解；上樣量不足；樣品制備錯誤）；制膠濃度比例不合適；轉膜不完全；一抗稀釋濃度過(guò)大；一抗與二抗不匹配；顯色系統靈敏度不足。

2.非特異性雜帶

原因：封閉或清洗不徹底；一抗濃度過(guò)高；蛋白降解；抗體的特異性差；蛋白形成二聚體；