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蛋白質(zhì)檢測(蛋白印跡法)

   蛋白印跡(Western blot, WB)是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種試驗方法,是將蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE電泳后,再轉移到雜交膜上,然后通過(guò)抗原抗體復合物對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性檢測的方法。



一、檢測原理
    

    待測蛋白根據其性質(zhì)(分子量、分子大小、電荷以及其等電點(diǎn))采用電泳方法進(jìn)行分離,通過(guò)電流將凝膠中的蛋白質(zhì)轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,利用一抗與抗原特異性結合的原理,以抗體作為探針釣取目的蛋白。


二、 樣品處理及上樣


1、取15-20ug蛋白,加2倍SDS上樣緩沖液7ul,DDW定容至總體積14ul。

* 上樣總體積一般少于15ul,加樣孔的最大限度可加20ul樣品。


2、95℃孵育5min,使蛋白變性。


3、電泳槽內加入足夠的電泳液。


4、上樣,分子Marker也要一起上樣,用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,加樣器槍頭插到加樣孔中緩慢加入樣品。

*樣品吸出時(shí)不要吸進(jìn)氣泡。加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出,加下一個(gè)樣品時(shí),進(jìn)樣器槍頭需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,一面交叉污染,有條件最好加樣時(shí)一個(gè)樣品換一個(gè)槍頭。


三、 電泳


電泳條件:電壓200V,電流8mA,染料進(jìn)入分離膠時(shí)電流增加到16mA,時(shí)間一般2-3小時(shí)。


*溴酚藍剛跑出膠即可終止電泳進(jìn)行轉膜,也可以根據時(shí)間經(jīng)驗停止電泳。


*電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均,可采用銅染色或考馬斯亮藍染色檢測,如凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉膜則需要可逆的銅染法,否則采用不可逆考馬斯亮藍法。


*銅染色法:

    電泳膠用蒸餾水洗數秒鐘    加入0.3mol/LCuCl2染色5-10min    去離子水洗一次     暗室觀(guān)察藍色背景下出現的蛋白透明條帶    膠置于0.1-0.25mol/L Tris/0.25mol/L EDTA(PH 8.0)緩沖液中漂洗脫色兩次    電轉緩沖液中轉膜。


*考馬斯亮藍法:用40%雙蒸水/10%醋酸/50%甲醇的溶液固定膠中蛋白    考馬斯亮藍R-250染色室溫染色4h過(guò)夜,保持搖勻     轉入67.5%雙蒸水/7.5%醋酸/25%甲醇搖勻脫色   蛋白被染成深藍色。


四、 轉膜


    轉膜方式有半干式和濕轉兩種。半干式轉膜速度快,但高分子量蛋白轉膜效果較差。高分子量蛋白質(zhì)與膠相互作用較強,從膠中移出較難。因此,一般大于120-150kDa的蛋白用半干式轉膜時(shí),可選用堿性電轉緩沖液,也可在電轉緩沖液中加SDS。但SDS妨礙蛋白與膜的結合,尤其對小分子蛋白。濕轉成功率高,特別適用于大分子量(大于100kDa)的蛋白。

操作步驟:


1、 準備:切好的PVDF膜和濾紙置于甲醇5min,PVDF膜置于電轉緩沖液浸泡10min以上。


*轉一張膜需6張6cm×9cm濾紙和1張6cm×9cmPVDF膜,濾紙和膜的尺寸不能小余膠的尺寸,否則導致電流不能通過(guò)膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套,因手上的蛋白會(huì )污染膜。


2、 加有轉膜液搪瓷盤(pán)中放入轉膜用的已浸過(guò)的PVDF膜和濾紙。


3、 電泳結束后撬掉玻璃板取膠,除去小玻璃板,輕輕刮去濃縮膠。


4 、小心剝下分離膠蓋于已泡好的濾紙上。


5 、200V電壓,160mA穩流電,轉膜1h。


6 、轉完后將膜和濾紙扔掉,PVDF膜右上角用剪子切斷一小部分進(jìn)行標記,Marker用紅藍鉛筆進(jìn)行標記。


7、 PVDF膜放入PBS-T溶液,振蕩5min×3次。


五、 抗原-抗體反應


1 、儀器和設備


塑料盒、振蕩器。


2、 封閉


一般采用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉,室溫,30-60min。


*封閉液的濃度可以是(1%-5%),根據自己的條件摸索濃度就可以。


封閉液的配置除了PBS-T液之外也可以使用TBS-T液或10mmol/L Tris-HCL(PH 7.4)溶液。


3 、一抗的處理


(1)一抗稀釋倍數:根據樣本和抗體的種類(lèi)不同,預實(shí)驗尋找選擇最適稀釋倍數。


(2)一抗孵育時(shí)間:一抗的孵育時(shí)間是從幾個(gè)小時(shí)到過(guò)夜不等,建議使用較高較高的稀釋倍數和較長(cháng)的孵育時(shí)間來(lái)保證特異性結合。一抗過(guò)高會(huì )產(chǎn)生非特異性條帶。


(3)一抗孵育時(shí)間:盡可能低溫孵育,特別是磷酸化一抗過(guò)夜時(shí)應在4℃進(jìn)行,否則會(huì )產(chǎn)生污染而破壞磷酸化蛋白。


*孵育一抗最好在搖床上進(jìn)行,防止結合不均勻。


4 、二抗的處理


(1)常用二抗:HRP偶聯(lián)二抗。也可用堿性磷酸酶標記二抗,但不夠靈敏。


(2)二抗稀釋液:PBS/PBS-T液、TBS/TBS-T液、一般的封閉液等。


(3)二抗稀釋倍數:根據二抗說(shuō)明書(shū)推薦倍數稀釋二抗。也可按1:100-1:20000常規稀釋倍數進(jìn)行預實(shí)驗選擇最適稀釋倍數。如二抗的濃度過(guò)高可導致非特異性條帶。


二抗孵育時(shí)間:一般室溫孵育1h。


5 、實(shí)驗步驟


(1)封閉結束后,用PBS-T液輕輕清洗膜,去除封閉液。


(2)用一抗室溫孵育1h或4℃過(guò)夜。


(3)PBS-T液清洗,10min×3次。


(4)二抗孵育,室溫,1h。


(5)PBS-T液清洗,10min×3次。


(6)用顯色液顯色。


六 、顯色


酶和底物反應顯色是蛋白印跡法的最后一步,一般常用酶有HRP和AP,根據成像底物可分為顯色底物和發(fā)光底物。發(fā)光底物可選用HRP標記二抗,顯色底物可選用HRP標記二抗或AP標記二抗。顯色分為酶促底物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光或熒光法。


1、HRP標記二抗


(1)酶促底物發(fā)光法


DAB顯色液配制:50ml

配方如下:

DAB
1mol/L Tri-HCL(pH 7.4)

DDW


*現配現用,避光保存。


*顯色前每50ml加入30%過(guò)氧化氫7.5ul。


*敏感性較ECL差。DAB是致癌物質(zhì),配制時(shí)應戴手套。顯色后膜可用DDW清洗,風(fēng)干保存。


2、AP標記二抗


顯色液配置


(1)100×氯化硝基四氮唑藍(NBT):


10ml配方如下:


NBT                   0.33g


70%二甲基甲酰胺       10ml


*1.5ml離心管分裝后冷凍保存,可保存數月。


(2)100×溴氯吲哚基磷酸鹽(BCIP):


10ml配方如下:


BCIP                  0.165g


100%二甲基甲酰胺      10ml


*難溶時(shí)用10ml蒸餾水,配成50×溶液。分裝冷凍保存,可保存數月。


3.堿性磷酸酶緩沖液:100ml配方如下。


1mol/L Tris-HCL(pH 9.5)                 10ml


5mol/L NaCl                           2ml


1mol/L MgCl2                         0.5ml


DDW                                87.5ml


*冷藏保存,可保存數月。


4、顯色液


100BCIP                              0.1ml


100×NBT                             0.1ml


*顯色后用DDW清洗,風(fēng)干保存。


七、蛋白印跡實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題及原因分析


1. 沒(méi)有帶?


原因:樣品中抗原含量不足(抗原表達量過(guò)低;蛋白降解;上樣量不足;樣品制備錯誤);制膠濃度比例不合適;轉膜不完全;一抗稀釋濃度過(guò)大;一抗與二抗不匹配;顯色系統靈敏度不足。


2.非特異性雜帶


原因:封閉或清洗不徹底;一抗濃度過(guò)高;蛋白降解;抗體的特異性差;蛋白形成二聚體;
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