小泛素相關(guān)修飾（SUMO）是生物內極為重要的一種蛋白翻譯后修飾方式，是一類(lèi)廣泛存在于真核生物中且高度保守的蛋白質(zhì)家族，它在調節蛋白質(zhì)間相互作用、定位、轉運、轉錄、細胞周期以及拮抗泛素化等方面均發(fā)揮著(zhù)重要的作用。

SUMO修飾是指SUMO共價(jià)結合于靶蛋白的賴(lài)氨酸殘基上，類(lèi)似于泛素化但又不同于泛素化。SUMO通常是非活性的前體形式存在，在酶作用下水解幾個(gè)氨基酸暴露出C端雙甘氨酸殘基，成為具有活性的SUMO分子。當ATP存在時(shí)，經(jīng)SUMO活化酶E1、SUMO結合酶E2、SUMO連接酶E3的連續作用，最終與靶蛋白底物耦聯(lián)形成異肽鍵，完成底物的SUMO修飾。

SUMO背景介紹：

SUMO化修飾與一些重要疾病相關(guān)聯(lián)。SUMO 化能影響淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生淀粉樣β肽(A β),其機制尚不清楚。過(guò)表達SUMO23,誘導SUMO化 蛋白增加可抑制?β的產(chǎn)生,過(guò)表達SUMO232K11R (其參與形成多SUMO鏈的賴(lài)氨酸殘基敲除)則可 產(chǎn)生相反的效應,說(shuō)明單SUMO化可增強?β的形成,而多SUMO化則抑制?β的形成。多聚谷氨酸(polyQ)重復擴增可引起何杰金氏病(HD)、脊髓小腦共濟失調、Machado2Joseph病和 延髓脊髓性肌萎縮等神經(jīng)退行性疾病。研究顯示,患這些疾病的患者受損腦區神經(jīng)元SUMO21染色增強,說(shuō)明SUMO化修飾也參與調節polyQ的重復擴增。應用HD果蠅模型證明Huntingtin(Htt)的polyQ區的一個(gè)片段,既可被SUMO化,又可被泛素化。泛素化可消除神經(jīng)退行性變,然而SUMO化則可加劇神經(jīng)退行性變。SUMO化的Htt穩定,不易聚集,具有較強的抑制轉錄能力。SUMO化促進(jìn)可溶性毒性Htt寡聚體的聚集,通過(guò)抑制轉錄而 介導神經(jīng)退行性變。

1、感受態(tài)細胞的制備

（1）準備LB培養基：0.5%酵母浸提物、1%胰蛋白胨、1%NaCl(PH 7.0),高壓滅菌，4℃保存備用。

（2）準備LB瓊脂平板：取新鮮配置的100-200ml的LB培養基，加入1.5g瓊脂糖，高壓滅菌，冷卻至60℃，液體倒入已消毒的平皿中，凝固后4℃保存備用。

（3）無(wú)菌條件下，用接種環(huán)蘸取少量大腸埃希菌DH5a或IM109菌液，在不含抗生素的LB瓊脂糖平板上劃線(xiàn)，37℃過(guò)夜培養。

（4）從LB平板上挑取一個(gè)單菌落，放入含2mlLB培養基的試管中，37℃恒溫搖床220rpm振蕩培養過(guò)夜。

（5）取500ul菌液，轉入含50mlLB培養基的培養瓶中，37℃恒溫搖床180rpm振蕩培養至OD600=0.8-1.0。

（6）7000g，4℃，離心5min收集細胞。

（7）用25ml預冷50mmol/L CaCl2 溶液重懸細胞，冰浴30min。

（8）6000g，4℃，離心5min收集細胞。

（9）用4ml預冷100mmol/L CaCl2 溶液重懸細胞。

（10）加入1ml甘油混勻，100ul/凍存管分裝，-80℃保存備用。

2.SUMO基因重組質(zhì)粒的轉化及擴增

（1）取10ngSUMO基因重組質(zhì)粒，加入50ulDHα或JM109感受態(tài)細胞。

（2）冰浴30min 到42℃水浴，熱休克60-90s 到冰浴5min。

（3）在試管中加入950ul不含抗生素的LB培養基，37℃恒溫搖床220rpm振蕩孵育40-60min。

（4）4℃4000g，離心2min收集細胞。

（5）取20ul菌液放入含抗生素LB瓊脂糖平板，將細菌均勻涂至整個(gè)平板表面。

（6）37℃恒溫培養箱中培養16-24h。

（7）試管中加入2-5ml含抗生素的LB培養基，挑取單克隆菌落放入試管。

（8）37℃恒溫振蕩培養過(guò)夜。

2.SUMO質(zhì)粒DNA的提取

（1）用1.5ml離心管取少量菌液，離心后棄掉上清液。

（2）用250ul P1溶液重懸菌株，漩渦振蕩使菌液重新完全懸浮。

（3）加入250ulP2溶液，輕輕渦旋4-6次混勻。

（4）加入350ulN3溶液，輕輕渦旋4-6次混勻。

（5）13000rpm（或17900×g）離心10min。

（6）用移液槍輕輕吸出上清放入QIAprep spin柱中，放置1-2min。

（7）13000rpm離心30-60s，棄濾液。

（8）500ul PB緩沖液，13000rpm 離心30-60s，棄掉濾液。

（9）加入750ul的PE緩沖液，13000rpm離心30-60s，棄掉濾液。

（10）13000rpm再次離心1min，甩干殘留液體。

（11）將QIAprep spin柱置于一個(gè)新的1.5ml離心管中，加入50ul的EB溶液，室溫放置10min。

（12）13000rpm離心1min，管底即為質(zhì)粒DNA。

（13）檢測質(zhì)粒DNA的濃度。

（14）-20℃保存備用。

3.SUMO質(zhì)粒瞬時(shí)轉染

（1） 將生長(cháng)狀態(tài)良好的細胞接種于直徑4-6cm的培養皿中，5% CO2，37℃培養箱內培養16-24h，細胞融合至60%-90%時(shí)可進(jìn)行轉染。

（2） 轉染前1h將細胞培養液換成不含抗生素的培養液。

（3） 用Opti-EME培養液稀釋4倍的Lipo2000試劑。

（4） 用Opti-EME培養液稀釋SUMO質(zhì)粒。

（5） 將上兩步溶液按1:1比例混合配成轉染復合液，室溫，孵育20min。

（6） 將已接種細胞的培養皿中加入200ul轉染復合液，充分混勻。

（7） 繼續培養4-6h，更換正常培養液。

（8） 培養24-72h，鏡下觀(guān)察和檢測帶有熒光標記的SUMO質(zhì)粒的表達。

4.帶標簽的SUMO的制備（以His-SUMO為例）

（1）培養細胞、誘導及收獲。

（2）每200ml菌液收獲的菌體加入5ml His裂解液，重懸沉淀。

（3）冰浴條件下，超聲破碎沉淀。

（4）4℃，10000rpm，離心1h

（5）取上清液，加入Ni-NTA agarose，4℃，混合1-2h。

（6）將混合物裝柱用His洗滌液洗滌，直到檢測不到蛋白濃度。

（7）His洗脫液進(jìn)行洗脫，按洗脫次序每管收集500ul。

（8）考馬斯亮藍染色檢測蛋白。

5.SUMO化蛋白的檢測

（1）培養細胞，待細胞融合至90%左右。

（2）PBS洗滌細胞2次，0.25%胰酶消化細胞。

（3）1000rpm，離心3-5min收集細胞。

（4）PBS洗滌細胞2次。

（5）1000rpm，離心3-5min，棄掉上清液。

（6）加入50ul細胞裂解液，冰浴10min。

（7）4℃，12000g，離心15min。

（8）取上清液，檢測蛋白濃度。