免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過(guò)化學(xué)反應使標記抗體的顯色劑  (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來(lái)確定組織細胞內抗原 (多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。根據標記物的不同分為：免疫酶法、免疫熒光法、親和組織化學(xué)法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三種最常用。

      即用型(Envision)快速酶免疫組化二步法鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結SP法卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復合物（ABC）法鏈霉親和素—生物素—過(guò)氧化物酶復合物（SABC）法
實(shí)驗方法原理  根據聚合酶技術(shù)把辣根過(guò)氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結合后，加入底物顯色。

     實(shí)驗材料： 石蠟切

     試劑、試劑盒： PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強劑酶標抗鼠 兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹(shù)膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺

      儀器、耗材： 烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管

     實(shí)驗步驟：

    1.  石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時(shí)，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。

    2.  取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻，從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’。（注：不是所有的抗體都需要微波修復的，視具體情況而定）

    3.  每張切片加1滴3%H2O2，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。

    4.  除去PBS液，每張切片加1滴相應的第一抗體（相應稀釋倍數），室溫下孵育2小時(shí)。

    5.  PBS沖洗3×5’。除去PBS液，每張切片加1滴聚合物增強劑，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。

    6.  除去PBS液，每張切片加1滴酶標抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。

    7.  除去PBS液，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液（二氨基聯(lián)苯胺），顯微鏡下觀(guān)察5分鐘。

    8.  蘇木素復染，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗，藍化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，晾干后觀(guān)察。

    其他

    一、特點(diǎn)

    1.  在切片加上一抗后，第二抗體標記多聚螯合物酶（HRP）的復合物與一抗結合，在多聚螯合物上有大量的HRP分子，使抗原信號有顯著(zhù)的放大，其敏感性較SABC、SP法高。

    2.  由于多聚物在體內不存在，又不使用生物素，從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色，背景比SABC、SP法清晰。

    3.  辣根過(guò)氧化物酶與二抗結合在多聚物上，替代傳統方法的 二抗、三抗，減少了實(shí)驗步驟，且試劑孵育時(shí)間短，只需15分鐘，使得免疫組化方法更簡(jiǎn)單，實(shí)驗時(shí)間比SABC、SP法大為縮短。

     免疫組化從失敗到成功需要注意：操作都要求很細致、抗原和抗體匹配、二抗的種屬選擇正確、一抗的稀釋度和二抗的稀釋度匹配、DAB顯色時(shí)間、復染時(shí)間一定要控制好、對照設置。