亚洲国产一级毛片视频-无码人妻久久一区二区三区-国产一级黄色毛片视频-精品中文字幕久久久久久-亚洲精品影院综合在线观看

新浪微博
微信互動(dòng)

蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺—酵母雙雜交系統的發(fā)展和應用

隨著(zhù)對多種重要生物的大規?;蚪M測序工作的完成,基因工程領(lǐng)域又迎來(lái)了一個(gè)新的時(shí)代---功能基因組時(shí)代。它的任務(wù)就是對基因組中包含的全部基因的功能加以認識。生物體系的運作與蛋白質(zhì)之間的互作密不可分,例如:DNA合成、基因轉錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、修飾和定位以及信息傳導等重要的生物過(guò)程均涉及到蛋白質(zhì)復合體的作用。能夠發(fā)現和驗證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認識它們生物學(xué)功能的第一步。

酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現和研究在活細胞體內的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺,在近幾年來(lái)得到了廣泛運用。酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的,研究活細胞內蛋白質(zhì)相互作用,對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到,它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究文獻表明,酵母雙雜交技術(shù)既可以用來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作,也可以用來(lái)研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此,它在許多的研究領(lǐng)域中有著(zhù)廣泛的應用。本文就酵母雙雜交的技術(shù)平臺和應用加以介紹。

酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過(guò)程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子,例如酵母轉錄因子GAL4在結構上是組件式的(modular),往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結構上可以分開(kāi),功能上相互獨立的結構域(domain)構成,其中有DNA結合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉錄激活結構域(activation domain,DNA-AD)。這兩個(gè)結合域將它們分開(kāi)時(shí)仍分別具有功能,但不能激活轉錄,只有當被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當的途徑在空間上較為接近時(shí),才能重新呈現完整的GAL4轉錄因子活性,并可激活上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)的下游啟動(dòng)子,使啟動(dòng)子下游基因得到轉錄。

根據這個(gè)特性,將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構建在同一個(gè)表達載體上,在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構建在A(yíng)D-LIBRARY表達載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉化改造后的酵母,這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏這些營(yíng)養的培養基上無(wú)法正常生長(cháng)。當上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時(shí),功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1,從而通過(guò)功能互補和顯色反應篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái),從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。在酵母雙雜交的基礎上,又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結構和位點(diǎn)。

基于酵母雙雜交技術(shù)平臺的特點(diǎn),它已經(jīng)被應用在許多研究工作當中。
  

1、利用酵母雙雜交發(fā)現新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能
      

酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現新基因的主要途徑。當我們將已知基因作為誘餌,在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白,從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體,并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機插入的cDNA片段,并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較,研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外,也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。例如:Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平臺,從成人腦cDNA文庫中發(fā)現了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1,并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。為了研究?jì)蓚€(gè)蛋白之間的相互作用的結合位點(diǎn),找到影響或抑制兩個(gè)蛋白相互作用的因素,Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個(gè)氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個(gè)氨基酸殘基之間是相互作用的位點(diǎn)。研究它們之間的相互作用位點(diǎn)有利于基因治療藥物的開(kāi)發(fā)。


2、利用酵母雙雜交在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用


利用酶聯(lián)免疫(ELISA)、免疫共沉淀(CO-IP)技術(shù)都是利用抗原和抗體間的免疫反應,可以研究抗原和抗體之間的相互作用,但是,它們都是基于體外非細胞的環(huán)境中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用。而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過(guò)酵母雙雜交進(jìn)行檢測。例如:來(lái)源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應中,抗體的單鏈的三個(gè)可變區A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術(shù),將DFR作為誘餌蛋白,編碼抗體的三個(gè)可變區的基因分別被克隆在A(yíng)D-LIBRARY載體上,將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉化改造后的酵母菌株中,并檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性,從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。


3、利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥 物對蛋白質(zhì)之間相互作用的影響


酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發(fā)疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法,阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如:Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病,研究發(fā)現它的病毒RNA復制與依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶(NS5)與拓撲異構酶NS3,以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關(guān)。研究人員通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用,就可以阻止RNA病毒的復制,從而達到治療這種疾病的目的。


4、利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖(Genome Protein Linkage Map)


眾多的蛋白質(zhì)之間在許多重要的生命活動(dòng)中都是彼此協(xié)調和控制的?;蚪M中的編碼蛋白質(zhì)的基因之間存在著(zhù)功能上的聯(lián)系。通過(guò)基因組的測序和序列分析發(fā)現了很多新的基因和EST序列,HUA等人利用酵母雙雜交技術(shù),將所有已知基因和EST序列為誘餌,在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白,從而找到基因之間的聯(lián)系,建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動(dòng):如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。

(本文轉載百度學(xué)術(shù))

上一篇:蛋白質(zhì)檢測(體外SUMO修飾實(shí)驗)
下一篇:脂肪氧化酶活性測定
分享到: