TNF-α生物學(xué)活性檢測方法
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發(fā)布時(shí)間：2017-07-31
基本原理
TNF的生物學(xué)活性之一是能直接殺傷腫瘤細胞。TNF與相應受體結合后向細胞內移，被靶細胞溶酶體攝取導致溶酶體穩定性降低，各種酶外泄，引起細胞溶解。腫瘤細胞株對TNF-α的敏感性有很大的差異，用放線(xiàn)菌素D、絲裂酶素C、放線(xiàn)菌酮等處理腫瘤細胞，可明顯增強TNF-α殺傷腫瘤細胞活性。
材料和試劑
1，完全培養基（1）10%FCS-DMEM培養液（V/V）。
2，完全培養基（2）3%FCS-DMEM培養液（V/V）0.5-1μg/ml放線(xiàn)菌素-D。
3，0.05%結晶紫溶液：取50mg結晶紫，用20ml無(wú)水乙醇溶解后，加水定容至100ml，室溫保存。
4，脫色液： H2O 50mg 無(wú)水乙醇 50mg 乙酸 0.1ml混勻即可。
5，TNF標準品：由中國藥品生物制品檢定所提供。
實(shí)驗操作
1，此實(shí)驗在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，實(shí)驗前超凈工作臺應用紫外燈照射30分鐘以上。
2，用完全培養基（1）將生長(cháng)狀態(tài)良好的小鼠L929細胞調至1×105/ml的細胞懸液，100μg/孔加入96孔細胞培養板，5%CO2，37℃培養過(guò)夜。
3，標準品稀釋?zhuān)河猛耆囵B基（2）將標準品進(jìn)行10倍稀釋至100IU/ml為起始濃度，再做4倍稀釋上板。
4，待檢樣品稀釋?zhuān)河猛耆囵B基（2）將待檢樣品進(jìn)行10倍稀釋至一定范圍，再做4倍稀釋準備上板。
5，棄96孔細胞培養板上清，將標準品及待檢樣品按100μl/孔加入96孔細胞培養板，同時(shí)設對照組和空白組，5%CO2，37℃培養16小時(shí)。
6，鏡檢后，棄上清，每孔加30μl 0.05%結晶紫染色3~5分鐘，用流水小心沖去結晶紫，甩干培養孔中的殘余水份，加入脫色液100μl/孔，用酶標儀測定570nm的光密度值。
結果計算
1，在座標紙上以OD570比色值（雙孔比色值的平均值）對稀釋倍數作圖，以標準品的最紙、最高平均值作平等于X軸的直線(xiàn)，以各相應樣品曲線(xiàn)與該直線(xiàn)的交點(diǎn)，在X軸讀出半效量的稀釋度。
2，計算公式：TNF活性（IU/ml）=標準品效價(jià)×樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數×標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效稀釋度。
（本文轉載丁香通）
