一、原理：

      免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細胞內存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

      其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實(shí)驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

二、準備工作：

      預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機

      1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS；

      2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個(gè)細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)

      3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動(dòng)15min（EP管插冰上，置水平搖床上）

      4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個(gè)新的離心管中

      5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

      6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景

      7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子

      8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線(xiàn)，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個(gè)月）

      9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl）

      10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異

      11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育

      12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl"過(guò)渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）

      13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時(shí)候會(huì )破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS

      14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道）

      15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。

RIPA Buffer配制：

基礎成分：

      Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）

      NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）

      NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液）

      去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存）

      注意：準備激酶（致活酶）實(shí)驗時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失。

RIPA蛋白酶抑制劑

      苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存）

      EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液，PH 7.4）

      亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

      抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

      胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制劑

      激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的儲存液，見(jiàn)Sodium Orthovanadate Activation Protoco）

      NaF（200mM的儲存液，室溫保存）

      注意：在準備做磷酸（酯）酶實(shí)驗的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑


工作液配制：

      配制100ml的modified RIPA buffe：

      1. 稱(chēng)取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4

      2. 加10 ml 10%的NP-40

      3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清

      4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存

      5. 理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會(huì )降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。

各種成分在工作液中的終濃度：

      * Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4

      * NP-40: 1%

      * 去氧膽酸鈉：0.25%

      * NaCl: 150 mM

      * EDTA: 1 mM

      * PMSF: 1 mM

      * 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 μg/ml

      * Na3VO4: 1 mM

      * NaF: 1 mM

三、實(shí)驗流程為：

     （1）轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C，最大轉速離心30 min后取上清；

     （2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過(guò)夜；

     （3）取10μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；
    
     （4）將預處理過(guò)的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；

     （5）免疫沉淀反應后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

     （6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。通過(guò)免疫共沉淀確定結合蛋白

      1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。

      2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 min。

      3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當抗體，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物1 h。

      4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動(dòng)免疫沉淀物30 min。

      5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。最后，用NETN洗一次。
   
      6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。

      7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過(guò)夜。

      8．通過(guò)考馬斯藍染色觀(guān)察蛋白質(zhì)泳帶。

      9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。

      10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。

      11． 通過(guò)窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在A(yíng)BI 477A或494A機器上進(jìn)行自動(dòng)Edman降解測序。

四、注意的問(wèn)題：

     （1）細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。

     （2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用

     （3）使用對照抗體：

      單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類(lèi)單抗

      兔多克隆抗體：正常兔IgG

      在免疫共沉淀實(shí)驗中要保證實(shí)驗結果的真實(shí)性，應注意以下幾點(diǎn)：

      (1) 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；

      (2) 要確?？贵w的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會(huì )引起共沉淀；

      (3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

      （本文轉載丁香通）