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血紅蛋白電泳(hemoglobin electrophoresis)

實(shí)驗原理

      血紅蛋白電泳(hemoglobin electrophoresis)目的是檢出和確認各種正常和異常的血紅蛋白。
 
      根據不同的血紅蛋白帶有不同的電荷,等電點(diǎn)不同,在一定的pH緩沖液中,血紅蛋白的等電點(diǎn)小于緩沖液的pH時(shí)帶負電荷,電泳時(shí)在電場(chǎng)中向陽(yáng)極泳動(dòng),反之,Hb帶正電荷向陰極泳動(dòng)。在一定電壓下,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳,不同的血紅蛋白所帶電荷不同,分子量不同,其泳動(dòng)方向和速度不同,可分離出各自的區帶,同時(shí)對電泳出的各區帶進(jìn)行比色或電泳掃描,可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析。一般最常用的是pH8.6醋酸纖維薄膜電泳。

      胞漿內存在糖原或多糖類(lèi)物質(zhì)(如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等)中的乙二醇基(CHOH-CHOH)經(jīng)過(guò)碘酸(periodic acid)氧化,轉變?yōu)槎┗–HO-CHO),與雪夫(Schiff )試劑中的無(wú)色品紅結合,形成紫紅色染料而沉積于細胞內多糖所在處。該反應稱(chēng)為過(guò)碘酸-雪夫(PAS)陽(yáng)性反應,以前也稱(chēng)為糖原染色。

實(shí)驗方法

材料

      1. 緩沖液

      (1)pH8.6 TEB緩沖液:稱(chēng)取Tris10.29 g,EDTA 0.6 g,硼酸3.2 g,加蒸餾水至1000 ml。

      (2)硼酸鹽緩沖液:稱(chēng)取硼砂6.87 g,硼酸5.56 g,加蒸餾水至1000 ml。

      2. 醋酸纖維薄膜、電泳儀、加樣器、分光光度計、比色杯。

方法:

      1. 血紅蛋白溶液的制備

      取肝素或者枸櫞酸鈉抗凝血3 ml,2000 rpm離心10分鐘后棄去血漿;用生理鹽水洗滌紅細胞三次(750 rpm,離心5分鐘),再2200 rpm,離心10分鐘,棄去上清液;加入等量的蒸餾水;再加入0.5倍體積四氯化碳,用力振搖5分鐘,2200 rpm,離心10分鐘后將上層Hb液吸出備用。

      2. 浸膜

      將醋酸纖維薄膜剪成3 cm×8 cm的紙條,浸入pH8.6 TEB緩沖液,浸透后取出,用濾紙吸干。

      3. 點(diǎn)樣

      用加樣器取血紅蛋白液10 μl,然后垂直點(diǎn)樣到醋酸纖維膜上(毛面),距邊緣1.5 cm處。

      4. 電泳

      將硼酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液倒入電泳槽中,將點(diǎn)樣后的醋酸纖維膜放于電泳槽架上,點(diǎn)樣在陰極端,200 V,30分鐘。

      5. 洗脫

      分別剪下HbA、HbA2,放入試管內,分別加入蒸餾水15 ml和3 ml,輕輕振蕩,待血紅蛋白完全洗脫后,混勻。

      6. 比色

      洗脫液用蒸餾水空白調零,415 nm測定吸光度。

      7. 計算

      HbA2(%)=HbA2管吸光度/(HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度)×100%

實(shí)驗結果計算

      pH8.6 TEB緩沖液醋酸纖維電泳參考范圍:HbA>95%,HbA2 1%-3.1%

注意事項

      1. 電泳時(shí)間不能太長(cháng),電泳時(shí)醋纖膜不能變干,故應觀(guān)察到HbA和HbA2清晰分開(kāi)就停止電泳,電泳時(shí)間太長(cháng)區帶反而擴散模糊;

      2. 點(diǎn)樣量不能太多,如血紅蛋白液太多,色帶易脫落或染色不透,可出現HbA相對增高的假陽(yáng)性結果;

      3. 避免醋酸纖維膜被蛋白質(zhì)污染;

      4.電流不應過(guò)大,否則血紅蛋白分不開(kāi)帶;

      5.應同時(shí)做正常人和必要的已知異常血紅蛋白的標本對照。


      (本文轉載丁香通)

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