隨著(zhù)半干轉印系統不斷進(jìn)步,有越來(lái)越多的方法被應用于加速轉印過(guò)程。例如,用戶(hù)可以通過(guò)更換轉印緩沖液、使用不同的轉印裝置,或調整轉印條件、修改實(shí)驗設計,從而縮短實(shí)驗時(shí)間。這些方法對需要快速得到結果并做出正確判斷的用戶(hù)非常有用,比如從事臨床檢驗工作的用戶(hù)。使用傳統半干轉印方法過(guò)去通常需要40?60分鐘完成一次轉印,而現在通過(guò)使用快速緩沖液,Yrdimes?半干轉印系統可以在7分鐘之內完成蛋白質(zhì)高效快速轉印。Yrdimes?半干轉印系統可以通過(guò)較少的轉移緩沖液實(shí)現快速和有效的轉印,特別是在縮短篩選大量樣品所耗時(shí)間方面,Yrdimes?半干轉印系統可在40?60分鐘內同時(shí)運行最多12塊7×10cm的丙烯酰胺凝膠。此外,Yrdimes?半干轉印系統中配備鍍鉑鈦陽(yáng)極板和不銹鋼陰極板,可實(shí)現高度均勻電場(chǎng),使轉印效果更均勻,機器使用壽命更長(cháng)。
轉印緩沖液為兩電極間的化學(xué)環(huán)境提供電學(xué)連續性,從而在保持蛋白質(zhì)溶解度的同時(shí),不對蛋白質(zhì)與固相轉印膜的結合產(chǎn)生阻礙。轉印緩沖液的成分會(huì )影響轉印時(shí)間,使用通常傳統實(shí)驗用緩沖液在Yrdimes半干轉印系統中,需要約40分鐘轉印樣品,現在,使用Pierce?快速半干轉印緩沖液,實(shí)驗證明通過(guò)Yrdimes半干轉印系統只需在7?10分鐘內即可完成快速轉印。
材料
? 膜:0.45μm孔徑的PVDF膜(PolyScreen?轉印膜,PerkinElmer?)
? Yrdimes?半干轉印系統(Wealtec)
? V-GES垂直電泳系統(Wealtec)
? ProMarker Plus(Wealtec)和293T細胞裂解液。
? 考馬斯亮藍染色: 0.5 g CCB/1000 ml MetOH: H2O: AOAC = 45:45:10.
? 脫色溶液:MetOH:H2O:AOAC = 45:45:10。
? PVDF膜脫色溶液:MetOH:AOAC = 90:10。
? Pierce?快速半干轉移緩沖液,10X。(Thermo Scientific)
? Elite200電源(Wealtec)
? Dolphin-Doc 和 Dolphin-Chemi 的凝膠成像分析系統(Wealtec)
? 抗鼠β-肌動(dòng)蛋白IgG抗體(Santa Cruz 生物科技公司)
? 山羊抗鼠IgG-HRP抗體(Santa Cruz 生物科技公司)
? 化學(xué)發(fā)光試劑(Western LightningTM)
方法
? 用Wealtec V-GES灌膠模具制備12%的SDS-PAGE
? 在SDS-PAGE膠中使用ProMarker Plus或293T細胞裂解液作為樣本,用Elite 200電泳儀供電進(jìn)行垂直電泳分離。濃縮膠80V/20分鐘,分離膠120V/80分鐘。
? 在此期間,用1:10比例的去離子水稀釋10× Pierce?快速半干轉移緩沖液,并在使用前攪拌均勻。
? 在稀釋過(guò)的Pierce?快速半干轉印緩沖液中平衡四張轉印紙(?1.25 mm)和兩張超厚濾紙(約2.5 mm)10?15分鐘,輕輕振蕩搖勻。
? 用甲醇預潤濕PVDF膜1分鐘,蒸餾水數分鐘,并在稀釋后的Pierce?快速半干轉印緩沖液中平衡10?15分鐘。
? 電泳完成后,在超純水中平衡SDS-PAGE10?15分鐘,輕輕振蕩搖勻。
? 將SDS-PAGE放入稀釋后的Pierce?快速半干轉印緩沖液中,輕輕混合振蕩10?15分鐘使平衡。
? 在Yrdimes轉印槽的陽(yáng)極板上將轉印膜與凝膠的夾層組裝起來(lái),確保消除凝膠-膜各層之間的氣泡。
? 合上Yrdimes的上蓋向下按壓彈簧鎖,閉合上蓋。
? 用恒壓25 V轉印7?10分鐘。
? 在此之后,按照如下步驟染色:
(a)考馬斯亮藍染色:
(?。┦褂每捡R斯亮藍染色溶液給SDS-PAGE電泳和PVDF膜著(zhù)色30分鐘。
(ii)分別采用各自去色溶液去除著(zhù)色
(iii)使用Dolphin-DOC凝膠成像分析系統拍照保存。
(b)化學(xué)發(fā)光反應:
(?。┯?/span>TBST緩沖液洗滌PVDF膜10?30分鐘。
(ⅱ)將PVDF轉到帶有抗小鼠β肌動(dòng)蛋白IgG抗體(1:1000)的TBST緩沖液1小時(shí)。
(ⅲ)使用TBST緩沖劑對PVDF膜清洗10分鐘,重復三次。
(ⅳ)使用山羊抗 - 小鼠IgG-HRP抗體將PVDF轉至TBST緩沖劑中按照(1:3000)的比例浸泡1小時(shí)。
(ⅴ)使用TBST緩沖劑對PVDF膜清洗10分鐘,重復三次。
(vi)使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行染色。
(vii)使用Dolphin-Chemi mini成像系統進(jìn)行拍攝。曝光1分鐘并進(jìn)行10次疊加。
(本文轉載丁香園)