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蛋白質(zhì) Western Blot 低成本快速半干轉印方法

      隨著(zhù)半干轉印系統不斷進(jìn)步,有越來(lái)越多的方法被應用于加速轉印過(guò)程。例如,用戶(hù)可以通過(guò)更換轉印緩沖液、使用不同的轉印裝置,或調整轉印條件、修改實(shí)驗設計,從而縮短實(shí)驗時(shí)間。這些方法對需要快速得到結果并做出正確判斷的用戶(hù)非常有用,比如從事臨床檢驗工作的用戶(hù)。使用傳統半干轉印方法過(guò)去通常需要40?60分鐘完成一次轉印,而現在通過(guò)使用快速緩沖液,Yrdimes?半干轉印系統可以在7分鐘之內完成蛋白質(zhì)高效快速轉印。Yrdimes?半干轉印系統可以通過(guò)較少的轉移緩沖液實(shí)現快速和有效的轉印,特別是在縮短篩選大量樣品所耗時(shí)間方面,Yrdimes?半干轉印系統可在40?60分鐘內同時(shí)運行最多127×10cm的丙烯酰胺凝膠。此外,Yrdimes?半干轉印系統中配備鍍鉑鈦陽(yáng)極板和不銹鋼陰極板,可實(shí)現高度均勻電場(chǎng),使轉印效果更均勻,機器使用壽命更長(cháng)。
 
      轉印緩沖液為兩電極間的化學(xué)環(huán)境提供電學(xué)連續性,從而在保持蛋白質(zhì)溶解度的同時(shí),不對蛋白質(zhì)與固相轉印膜的結合產(chǎn)生阻礙。轉印緩沖液的成分會(huì )影響轉印時(shí)間,使用通常傳統實(shí)驗用緩沖液在Yrdimes半干轉印系統中,需要約40分鐘轉印樣品,現在,使用Pierce?快速半干轉印緩沖液,實(shí)驗證明通過(guò)Yrdimes半干轉印系統只需在7?10分鐘內即可完成快速轉印。

 
材料
 

      ? 膜:0.45μm孔徑的PVDF膜(PolyScreen?轉印膜,PerkinElmer?)
      ? Yrdimes?半干轉印系統(Wealtec
      ? V-GES垂直電泳系統(Wealtec
      ? ProMarker PlusWealtec)和293T細胞裂解液。
      ? 考馬斯亮藍染色: 0.5 g CCB/1000 ml MetOH: H2O: AOAC = 45:45:10.
      ? 脫色溶液:MetOH:H2O:AOAC = 45:45:10。
      ? PVDF膜脫色溶液:MetOHAOAC = 90:10。
      ? Pierce?快速半干轉移緩沖液,10X。(Thermo Scientific)
      ? Elite200電源(Wealtec
      ? Dolphin-Doc Dolphin-Chemi 的凝膠成像分析系統(Wealtec
      ? 抗鼠β-肌動(dòng)蛋白IgG抗體(Santa Cruz 生物科技公司)
      ? 山羊抗鼠IgG-HRP抗體(Santa Cruz 生物科技公司)
      ? 化學(xué)發(fā)光試劑(Western LightningTM
 
方法

      ? Wealtec V-GES灌膠模具制備12%的SDS-PAGE
      ? SDS-PAGE膠中使用ProMarker Plus293T細胞裂解液作為樣本,用Elite 200電泳儀供電進(jìn)行垂直電泳分離。濃縮膠80V/20分鐘,分離膠120V/80分鐘。
      ? 在此期間,用1:10比例的去離子水稀釋10× Pierce?快速半干轉移緩沖液,并在使用前攪拌均勻。
      ? 在稀釋過(guò)的Pierce?快速半干轉印緩沖液中平衡四張轉印紙(?1.25 mm)和兩張超厚濾紙(約2.5 mm10?15分鐘,輕輕振蕩搖勻。
      ? 用甲醇預潤濕PVDF1分鐘,蒸餾水數分鐘,并在稀釋后的Pierce?快速半干轉印緩沖液中平衡10?15分鐘。
      ? 電泳完成后,在超純水中平衡SDS-PAGE10?15分鐘,輕輕振蕩搖勻。
      ? SDS-PAGE放入稀釋后的Pierce?快速半干轉印緩沖液中,輕輕混合振蕩10?15分鐘使平衡。
      ? Yrdimes轉印槽的陽(yáng)極板上將轉印膜與凝膠的夾層組裝起來(lái),確保消除凝膠-膜各層之間的氣泡。


 

                                             
      ? 合上Yrdimes的上蓋向下按壓彈簧鎖,閉合上蓋。
      ? 用恒壓25 V轉印7?10分鐘。
      ? 在此之后,按照如下步驟染色:
      a)考馬斯亮藍染色:
      ?。┦褂每捡R斯亮藍染色溶液給SDS-PAGE電泳和PVDF膜著(zhù)色30分鐘。
      ii)分別采用各自去色溶液去除著(zhù)色
      iii)使用Dolphin-DOC凝膠成像分析系統拍照保存。
      b)化學(xué)發(fā)光反應:
      ?。┯?/span>TBST緩沖液洗滌PVDF10?30分鐘。
      ⅱ)將PVDF轉到帶有抗小鼠β肌動(dòng)蛋白IgG抗體(11000)的TBST緩沖液1小時(shí)。
      ⅲ)使用TBST緩沖劑對PVDF膜清洗10分鐘,重復三次。
      ⅳ)使用山羊抗 - 小鼠IgG-HRP抗體將PVDF轉至TBST緩沖劑中按照(13000)的比例浸泡1小時(shí)。
      ⅴ)使用TBST緩沖劑對PVDF膜清洗10分鐘,重復三次。
      vi)使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行染色。
      vii)使用Dolphin-Chemi mini成像系統進(jìn)行拍攝。曝光1分鐘并進(jìn)行10次疊加。
 

 


1. ProMarker Plus在不同條件下的轉印效率。使用5V(A)(B)25V(C)(D)恒電壓用Yrdimes轉印7分鐘,25V轉印10分鐘(E) (F)。左側是SDS-PAGE膠,右側是轉印后的PVDF膜。
 

 


2. SDS-PAGE膠向PVDF膜以25V電壓轉印7分鐘后,在系列稀釋的293T細胞裂解液中檢測到β-actin。圖中數字代表加載的293T細胞裂解液中的總蛋白含量。
 

討論

      在結果中,在Yrdimes半干轉印槽中使用Pierce快速半干轉印緩沖液,被證明使用25V恒電壓條件下7分鐘可以達到非常好的轉印效果 (圖一),轉印 后,膜上的蛋白質(zhì)也可以通過(guò)免疫學(xué)步驟用ECL化學(xué)發(fā)光染劑染色(圖二)。對比圖1中使用的不同恒定電壓之間轉印效果,我們發(fā)現使用Yrdimes?半干轉印系統電壓恒壓25 V(同時(shí)也是轉印緩沖液推薦電壓)將得到最好的轉印效果。通過(guò)使用不同長(cháng)度時(shí)間,可以看出只需要7分鐘即可完成很好的轉印效果。10分鐘轉印后,將有高達90%的蛋白質(zhì)被轉移到PVDF膜上。雖然轉印效果會(huì )隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)而提升,我們并不推薦轉印超過(guò)10分鐘。因為轉移超過(guò)十分鐘后,轉移效率并不會(huì )有顯著(zhù)增加,不僅如此,該過(guò)程還會(huì )產(chǎn)生更多的熱量并且增加了對凝膠和樣品的損害可能,這是因為對Yrdimes?半干轉印系統施加了25伏特的超高恒定電壓的緣故。 如圖2所示,該系列稀釋樣品的強度會(huì )隨著(zhù)樣品數量的降低而減小。 這也證明了Yrdimes?半干轉印系統可以很均勻地傳輸當與Pierce?快速半干式轉移緩沖液一起使用時(shí),該緩沖液對篩選大量樣品非常有幫助。這篇文章證明了Yrdimes?半干轉印系統可以在Pierce?快速半干式轉移緩沖液輔助下,將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE電泳高速高效轉印到PVDF膜上。實(shí)驗結果表明Wealtec Yrdimes?半干轉印系統不僅為用戶(hù)提供了一個(gè)更快捷的蛋白樣本轉印方案,更展示了該系統的操作靈活性、易用性。
 
 
REFERENCES

      ? Kurien, B.T., Scofield, R.H., 2003. Protein blotting: a review. J. Immunol. Methods.274: 1-15.
      ? Kurien, B.T., Scofield, R.H., 2006. Western blotting. Methods. 38: 283-293.
      ? Protein blotting application guide from Millipore Company.
      ? Pierce? Fast Semi-Dry Transfer Buffer instructions, Thermo Scientific.

      

      (本文轉載丁香園)

 

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