在網(wǎng)上看到有人把原核表達技術(shù)分成四個(gè)等級：初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門(mén)、系統優(yōu)化中級和自成一體高手，覺(jué)得十分有意思。但是根據筆者自己的經(jīng)驗以及耳聞目睹的一些經(jīng)歷告訴我：做表達？那是謀事在人，成事在天。有時(shí)候你把克隆做出來(lái)了，雙酶切鑒定沒(méi)問(wèn)題，測序沒(méi)問(wèn)題，可是就是看不到表達帶。原因當然可以分析，實(shí)驗也是可以改進(jìn)，但是竄改一下戈爾泰的話(huà)：“成功的實(shí)驗都是一樣的，失敗的實(shí)驗各有各的不幸?！痹趯?shí)驗遇到瓶頸的時(shí)候要如何進(jìn)行分析，找到問(wèn)題的癥結是我們的實(shí)驗關(guān)鍵所在。在準備進(jìn)行原核表達的時(shí)候需要考慮的因素很多，市面上可供選擇的載體、菌株也很多，要如何進(jìn)行正確的選擇，找到適合自己的載體是十分重要的。所以，現在要對目前常用的一些載體進(jìn)行介紹，讓我們對其相關(guān)產(chǎn)品及其表達原理進(jìn)行了解，以方便實(shí)驗設計。

     首先來(lái)一些大腸桿菌表達的基本概念：一個(gè)完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株，如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統或者Tag檢測等等。選擇表達系統通常要根據實(shí)驗目的來(lái)考慮，比如表達量高低，目標蛋白的活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。主要歸結在表達載體的選擇上。

     表達載體 ：我們關(guān)心的質(zhì)粒上的元件包括啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)，終止密碼，融合Tag（如果有的話(huà)），復制子，篩選標記/報告基因等。通常，載體很貴，我們可以通過(guò)實(shí)驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心，輾轉多個(gè)實(shí)驗室和多個(gè)實(shí)驗室成員之手的載體是否保持原來(lái)的遺傳背景？MCS是否還是原來(lái)那個(gè)MCS？是我們要特別注意的。

     復制子：通常表達載體都會(huì )選用高拷貝的復制子。pSC101類(lèi)質(zhì)粒是嚴謹方式復制，拷貝數低，pCoE1，pMBI(pUC)類(lèi)的復制子的拷貝數高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢岛捅磉_量是非線(xiàn)性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過(guò)細胞的承受范圍反而會(huì )損害細胞的生長(cháng)。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉化，就要考慮復制元是否相容的問(wèn)題。
篩選標記和報告基因 ：氨芐青霉素抗性是最常見(jiàn)的篩選標記，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一個(gè)載體的篩選標記用。四環(huán)素，紅霉素和氯霉素等已經(jīng)日漸式微?？剐曰虻倪x擇要注意是否會(huì )對研究對象產(chǎn)生干擾，比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問(wèn)題應該就是LB倒板前加抗生素的溫度，溫度過(guò)高容易導致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫，不知道是否有我們實(shí)驗人員的功勞呢？大家“隨便倒掉”已經(jīng)獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒(méi)有經(jīng)過(guò)煮沸或者消毒等處理呢？從以前的一針50萬(wàn)單位到現在100多萬(wàn)個(gè)單位，青霉素劑量似乎越來(lái)越大了。

     對于做表達來(lái)說(shuō)，如果不是要研究啟動(dòng)子的強弱，通常比較少關(guān)心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是最常用的報告基因了（注意選擇適用原核表達版本的GFP），其他還有半乳糖苷酶啊，熒光素酶啊等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

     啟動(dòng)子、終止子和核糖體結合位點(diǎn)

     啟動(dòng)子： 啟動(dòng)子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉錄模式上看有組成型表達和誘導調控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動(dòng)子

     組成型表達 ：表達載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統。持續性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長(cháng)有害的蛋白。因為過(guò)量或者有害的表達產(chǎn)物會(huì )影響細菌的生長(cháng)，反過(guò)來(lái)影響表達量的積累。

     誘導調控型表達 ：表達載體采用誘導型啟動(dòng)子，只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長(cháng)前期高表達對菌體生長(cháng)的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴(lài)的轉錄酶是誘導表達的，也屬于誘導表達系統。

     融合表達 ：表達載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達標簽（Tag），表達產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。

     分泌表達 ：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內的過(guò)度累積而影響細胞生長(cháng)，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間。

     可溶性表達 ：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動(dòng)子，目的蛋白來(lái)不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包含體容易純化但是復性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統。

     轉錄終止子 對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用――控制轉錄的RNA長(cháng)度提高穩定性，避免質(zhì)粒上異常表達導致質(zhì)粒穩定性下降。放在啟動(dòng)子上游的轉錄終止子還可以防止其他啟動(dòng)子的通讀，降低本底。轉錄終止子有兩類(lèi)，Rho因子作用下使轉錄終止mRNA和根據模版上的對稱(chēng)序列形成發(fā)夾結構而終止mRNA。常見(jiàn)的是rrnB  rRNA操縱子的T1T2串連轉錄終止子。

     核糖體結合位點(diǎn) ：?jiǎn)?dòng)子下游從轉錄起始位點(diǎn)開(kāi)始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的，多數載體啟動(dòng)子下游都有SD序列，也有些載體沒(méi)有，適合自帶SD序列的基因表達，要留意。

     表達菌株 ：我們往往最容易忽視的一點(diǎn)。不同的表達載體對應有不同的表達菌株，一些特別設計的菌株更有助于解決一些表達難題。同樣的，交換獲得的免費菌株，要小心其遺傳背景是否已經(jīng)發(fā)生改變？

     注：以上各種特性是可以相互組合的，不是排他的！

     幾個(gè)常用的啟動(dòng)子和誘導調控表達系統

     最早應用于的表達系統是Lac乳糖操縱子，由 啟動(dòng)子Plac + 操縱基因lacO + 結構基因組成。其轉錄受CAP正調控和lacI負調控。lacUV5突變能夠在沒(méi)有CAP的存在下更有效地起始轉錄，該啟動(dòng)子在轉錄水平上只受lacI的調控，因而隨后得到了更廣泛采用。lacI產(chǎn)物是一種阻遏蛋白，能結合在操縱基因lacO 上從而阻遏轉錄起始。乳糖的類(lèi)似物IPTG可以和lacI產(chǎn)物結合，使其構象改變離開(kāi)lacO，從而激活轉錄。這種可誘導的轉錄調控成為了大腸桿菌表達系統載體構建的常用元件。tac啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lacUV5的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉錄水平更高，比lacUV5更優(yōu)越。trc啟動(dòng)子是trp啟動(dòng)子和lac啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子，同樣具有比trp更高的轉錄效率和受lacI阻遏蛋白調控的強啟動(dòng)子特性。在常規的大腸桿菌中，lacI阻遏蛋白表達量不高，僅能滿(mǎn)足細胞自身的lac操縱子，無(wú)法應付多拷貝的質(zhì)粒的需求，導致非誘導條件下較高的本底表達，為了讓表達系統嚴謹調控產(chǎn)物表達，能過(guò)量表達lacI阻遏蛋白的lac  Iq   突變菌株常被選為L(cháng)ac/Tac/trc表達系統的表達菌株?，F在的Lac/Tac/trc載體上通常還帶有lac  Iq   基因，以表達更多lacI阻遏蛋白實(shí)現嚴謹的誘導調控。IPTG廣泛用于誘導表達系統，但是IPTG有一定毒性，有人認為在制備醫療目的的重組蛋白并不合適，因而也有用乳糖代替IPTG作為誘導物的研究。另外一種研究方向是用lacI的溫度敏感突變體，30度下抑制轉錄，42度開(kāi)發(fā)。熱誘導不用添加外來(lái)的誘導物，成本低，但是由于發(fā)酵過(guò)程中加熱升溫比較慢而影響誘導效果，而且熱誘導本身會(huì )導致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì )影響產(chǎn)物穩定。

     以 λ噬菌體再起轉錄啟動(dòng)子PL   、  P R     構建的載體也為大家所熟悉。這兩個(gè)強啟動(dòng)子受控于λ噬菌體  cI基因產(chǎn)物。cI基因的溫度敏感突變體cI857(ts)常常被用于調控PL   、 P R    啟動(dòng)子的轉錄。同樣也是30度下阻遏啟動(dòng)子轉錄，42度下解除抑制開(kāi)發(fā)轉錄。同樣的，PL   、 P R    表達載體需要攜帶cI857(ts)菌株作為表達載體，現在更常見(jiàn)的做法是在載體上攜帶cI857(ts)基因，所以可以有更大的宿主選擇范圍。另外一種思路是通過(guò)嚴謹調控cI產(chǎn)物來(lái)間接調控PL   、 P R    啟動(dòng)子的轉錄。比如Invitrogen的PL   表達系統，就是將受trp啟動(dòng)子嚴謹調控的cI基因溶源化到宿主菌染色體上，通過(guò)加入酪氨酸誘導抑制trp啟動(dòng)子，抑制cI基因的表達，從而解除強大的PL    啟動(dòng)子的抑制。

     T7啟動(dòng)子是當今大腸桿菌表達系統的主流，這個(gè)功能強大兼專(zhuān)一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過(guò)巧妙的設計而成為原核表達的首選，尤其以Novagen公司的pET系統為杰出代表。強大的T7啟動(dòng)子完全專(zhuān)一受控于T7 RNA 聚合酶，而高活性的T7 RNA 聚合酶合成mRNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍――當二者同時(shí)存在時(shí)，宿主本身基因的轉錄競爭不過(guò)T7表達系統，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。由于大腸桿菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要將外源的T7 RNA 聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA 聚合酶的調控模式就決定了T7系統的調控模式――非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉錄，從而避免目的基因毒性對宿主細胞以及質(zhì)粒穩定性的影響；通過(guò)控制誘導條件控制T7 RNA 聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有何高招？

     有幾種方案可用于調控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調控T7表達系統。

     1.噬菌體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有lacI抑制基因和位于lacUV5啟動(dòng)子下的T7 RNA 聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表達菌株，構建好的表達載體可以直接轉入表達菌株中，誘導調控方式和lac一樣都是IPTG誘導。

     2.另一種策略是用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對宿主細胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩定。然后用λCE6噬菌體侵染宿主細胞――CE6是lambda噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動(dòng)子控制T7 RNA 聚合酶的衍生株，在熱誘導條件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成。

     此了噬菌體之外，還可以通過(guò)共轉化質(zhì)粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調控T7 RNA 聚合酶合成，據說(shuō)這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。

     由于T7 RNA 聚合酶的調控方式仍有可能有痕量的本底表達，控制基礎表達的手段之一是培養基外加葡萄糖，有助于控制本底表達水平。2.是采用帶有T7lac 啟動(dòng)子的載體――在緊鄰T7 啟動(dòng)子的下游有一段lacI操縱子序列編碼表達lac 阻遏蛋白(lacI)，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7 RNA 聚合酶前的lacUV5 啟動(dòng)子并抑制其表達，也作用于載體T7 lac 啟動(dòng)子，以阻斷任何T7 RNA聚合酶導致的目的基因轉錄。pLacI工轉化也是同樣的原理。

     如果這還不夠，更為嚴謹調控手段還有――在宿主菌中表達另一個(gè)可以結合并抑制T7 RNA 聚合酶的基因――T7融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE，相容的ori都不會(huì )影響后繼的表達質(zhì)粒轉化，前者表達的溶菌酶的水平要比后者低得多，對細胞生長(cháng)影響小，而pLysE會(huì )明顯降低宿主菌的生長(cháng)水平，容易出現過(guò)度調節，增加蛋白表達的滯后時(shí)間，從而降低表達水平。

     通過(guò)幾種不同方法來(lái)巧妙調控T7聚合酶合成，T7啟動(dòng)子發(fā)展出了史上功能最強大，最豐富的表達系統。