在體外將兩個(gè)或多個(gè)來(lái)源相同或不相同的DNA片段連接成新的重組DNA分子，再轉到特定宿主細胞中進(jìn)行自主復制并表達。這是分子生物學(xué)中的基本技術(shù)。

 

     DNA重組技術(shù)的基本程序包括：

 

   （1）獲得外源DNA：外源DNA是進(jìn)行DNA重組的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶鏈式反應(PCR)或逆轉錄-DNA聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、基因組文庫或cDNA文庫篩選等方法獲得。

 

   （2）載體的構建或選擇：分子生物學(xué)中用的載體是指能在特定宿主細胞中自主復制的DNA分子，例如細菌的質(zhì)粒、噬菌體、病毒等，常用的載體一般為質(zhì)粒；根據需要可直接從公司購買(mǎi)合適的載體，也可以自己構建。

 

   （3）連接：目的DNA片段和適當載體的連接,一般采用核酸內切酶分別消化DNA片段和載體，使它們的末端能夠連接到一起構成重組DNA分子。由于所用內切酶的切割特點(diǎn)不同，產(chǎn)生三種連接方式：粘端連接、平端連接和不相配的連接。

 

   （4）轉化：將連接的重組DNA產(chǎn)物導入合適的宿主細胞，使其在宿主細胞內復制擴增或表達，賦予宿主細胞新的生物特征。

 

   （5）克隆化：重組DNA分子轉化大腸桿菌后，在平板培養基上篩選出單個(gè)菌落，此菌落經(jīng)過(guò)酶切鑒定或雜交實(shí)驗后確定為含重組DNA分子的單克隆。

 

    下面以質(zhì)粒為例圖示DNA體外重組的基本程序：

 

    一、基因組DNA的制備

 

    【實(shí)驗目的】

 

    1． 理解生物細胞基因組DNA制備方法的原理。

 

    2． 熟悉組織細胞基因組DNA制備的基本操作。

 

    【實(shí)驗原理】

 

     在陰離子去污劑（SDS-十二烷基硫酸鈉）以及酚/氯仿/異戊醇作用下可以使細胞膜破壞，核蛋白質(zhì)變性，將染色體DNA分離出來(lái)。

 

    【實(shí)驗對象】

 

     新鮮哺乳動(dòng)物組織或細胞。

 

    （一）從哺乳動(dòng)物組織中提取基因組DNA

 

    【實(shí)驗試劑與器材】

 

     1. 消化緩沖液：100mM NaCl，10mM Tris.Cl (pH8.0)　25mM EDTA (pH8.0)，0.5% (w/v) SDS，0.1mg/ml蛋白酶K。

 

     2. 7.5mol/L乙酸銨。

 

     3. 100%乙醇。

 

     4. 酚/氯仿/異戊醇。

 

    【實(shí)驗方法與步驟】

 

     1. 將新鮮組織剪成小塊并立即置于液氮中凍存；

 

     2. 將200mg～1g的組織用預冷的研缽研碎，或用錘子將其搗為細粉末，每100mg組織用1.2ml消化緩沖液懸浮，然后于50℃搖蕩溫育12~18h；

 

     3. 用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提樣品，1700×g，離心10min。如果樣品溶解得不好，再加1體積不含蛋白酶K的消化緩沖液，重復離心。如果在界面上有一層厚的白色物質(zhì)，重復抽提一次，將上層(水溶液)轉移至一個(gè)新離心管中；

 

     4. 加入1/2體積7.5mol/L乙酸銨和2倍體積100%乙醇，12 000rpm離心2min；

 

     5. 用70%乙醇洗滌，晾干，沉淀用TE緩沖液或無(wú)菌雙蒸水重新溶解,使終濃度在約1mg/ml。注: 加入0.1%的SDS和1?滋g/ml無(wú)DNA酶的RNA酶，37℃溫育1h，以除去殘留的RNA。

 

     6. 重復步驟4、5。1g細胞大約能提取到2mg DNA。

 

    （二）從植物組織中提取基因組DNA

 

    【實(shí)驗試劑與器材】

 

     1. CTAB抽提液：2% (w/v) CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，100mM Tris.Cl，pH8.0，  20mM EDTA，pH8.0，1.4M NaCl

 

     2. CTAB/NaCl溶液：10% CTAB，0.7M NaCl 配制方法：在80ml雙蒸水中溶解4.1g NaCl，然后緩慢加入10g CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，同時(shí)加熱并攪拌，可加熱至65℃溶解，定容終體積至100ml。

 

     3. CTAB沉淀液：  1% (w/v) CTAB，50mM Tris.Cl (pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)

 

     4. 高鹽TE緩沖液:  10mM Tris.Cl (pH8.0)，0.1mM EDTA (pH8.0)，1M NaCl

 

    【實(shí)驗方法與步驟】

 

     1. 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巰基乙醇，使終濃度達2% (v/v)。將此溶液及    CTAB/NaCl溶液加熱至65℃。對于每克新鮮的葉組織大約需要4ml的2-巰基乙醇/CTAB抽提液和0.4~0.5ml的CTAB/NaCl溶液；

 

     2. 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷凍勻漿器，將植物組織粉碎成為細粉，然后將冷凍的組織轉移到一個(gè)含有機溶劑的試管或燒瓶中；

 

     3. 往粉碎的組織中加入預熱的2-ME/CTAB，混合使之充分濕潤，于65℃溫育10~60min，期間不時(shí)混勻；

 

     4. 用等體積的24:1氯仿/異戊醇抽提勻漿液，上下顛倒充分混合，7500×g，4℃，離心5min，回收上層水相；

 

     5. 加入1/10倍體積的65℃預熱CTAB/NaCl溶液，上下顛倒混勻；

 

     6. 用等體積的氯仿/異戊醇抽提，混勻，離心，回收上層水相；

 

     7. 加入1倍體積的CTAB沉淀液，上下顛倒混勻，如果沉淀可見(jiàn)，繼續做步驟8，也可于65℃溫育30min；

 

     8. 500×g，4℃，(或約2700rpm)離心5min；

 

     9. 移出上清，用高鹽TE緩沖液重懸沉淀(按每克起始材料加0.5～1ml)，如果沉淀很難溶解，于65℃溫育直至所有的或大部分沉淀溶解；

 

     10. 加入0.6倍體積異丙醇沉淀核酸，充分混勻，7500×g，4℃，離心15min；

 

     11. 用75%乙醇洗滌沉淀物，干燥，用盡可能少的TE或水重懸(每克起始材料0.1～0.5ml)。

 

    【注意事項】

 

     基因組DNA分子量大，所有操作必須輕柔，酚/氯仿對皮膚有腐蝕作用，應該戴手套操作。