1. 蛋白質(zhì)純化法和序列分析法

     克隆DNA結合蛋白，首選蛋白質(zhì)純化法，在得到氨基酸序列后，設計PCR簡(jiǎn)并引物，用于擴增基因片段，最后通過(guò)cDNA文庫篩選得到全長(cháng)cDNA。該方法在共價(jià)交聯(lián)有目的DNA序列的寡核苷酸多聯(lián)體的柱層析樹(shù)脂中進(jìn)行。這種技術(shù)稱(chēng)為序列特異性DNA親和層析。DNA親和層析方法與常規的層析方法相似，但往往使用大量的蛋白質(zhì)使層析柱超載，這樣可以增加DNA親和層析的成功率。

     蛋白質(zhì)純化到某種程度后，在銀染的凝膠上會(huì )看到一條帶或多條帶，因此需要進(jìn)一步確定哪些條帶的蛋白質(zhì)與DNA結合活性相對應，可采用變性/復性、DNA―蛋白質(zhì)印跡法及交聯(lián)法進(jìn)行確定。相對而言，變性/復性技術(shù)能夠提供更多的信息。首先通過(guò)SDS―PAGE分離DNA親和純化樣品中的蛋白質(zhì)。電泳后，用刀片將凝膠上相關(guān)泳道切成多個(gè)凝膠塊。每個(gè)凝膠塊中的蛋白質(zhì)通過(guò)在合適的緩沖液中浸泡，進(jìn)行變性，并從聚丙烯酰胺中洗脫。洗脫后通過(guò)變性液逐級稀釋成非變性緩沖液，使蛋白質(zhì)復性，或者在非變性緩沖液中透析。然后，利用EMSA和DNase I足跡法分析每一個(gè)樣品，確定特異性DNA―蛋白質(zhì)結合活性的存在。

      2.  氨基酸序列分析及基因克隆

     對于已經(jīng)確定具有DNA特異性結合活性的蛋白質(zhì)可以通過(guò)測序獲得蛋白質(zhì)的部分肽段序列，也可以利用純化的蛋白質(zhì)制備抗體，篩選表達文庫。肽段測序法更為常用，具體過(guò)程是：將蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)法或酶切法切成小肽段，通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行測序，然后通過(guò)數據庫檢索進(jìn)行分析，確定它們是否與已知蛋白質(zhì)或表達序列標簽相對應。如果相對應，其基因或基因片段可以通過(guò)合適的途徑得到或通過(guò)RT―PCR進(jìn)行分離?？梢岳煤?jiǎn)并引物，通過(guò)多種PCR方法分離基因片段。PCR產(chǎn)物可以直接測序，也可以克隆進(jìn)常規載體后進(jìn)行測序。

     為了確認克隆得到的基因編碼目的蛋白質(zhì)，可通過(guò)兩種方法進(jìn)行驗證：①制備重組蛋白質(zhì)，將該重組蛋白質(zhì)的DNA結合特征和最初抽提物的DNA結合特征相比較，可以用EMSA方法檢測遷移率是否一致，或者用DNase I足跡法觀(guān)察保護模式是否相同。②制備抗重組蛋白質(zhì)或人工合成抗體的多肽，分析它們是否和抽提物及純化蛋白質(zhì)相互作用?？贵w能夠超變動(dòng)或破壞利用抽提物觀(guān)察到的EMSA復合體。

     對于與DNA相互作用的蛋白質(zhì)的克隆，也可以通過(guò)其他的方法進(jìn)行，如酵母單雜交等。