樣品：重組胰蛋白酶，比活 4000USP u/mg pro.，上海雅心生物技術(shù)有限公司，純度如圖 1 所示。BAEE，Sigma.

 

    圖 1. 重組胰蛋白酶的純度的 SDS-PAGE 鑒定

 

    1. 最適溫度的研究

 

     將底物 BAEE（0.25 mM）分別置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中溫浴 20 min，加入相同體積的 RPT 酶液測定 rPT 的活力，結果表示為測定數值占最高酶活的百分比。

     2. 溫度穩定性的研究

 

     取 10 mg/ml RPT 純酶液稀釋 10 倍后，分別置于 4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，70℃ 水浴中溫浴 2 h，每隔 20 min 取樣測定酶活，結果表示為測定數值占最高酶活的百分比。

 

      圖 2. a, RPT 最適溫度曲線(xiàn)；                       b, RPT 的溫度穩定性

 

     把底物分別放置在 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中，然后加入同體積的純酶液測活。圖 2a 顯示，溫度越高，測得的酶活也就越高。60℃ 酶反應速率很快，酶活最高，然而溫度繼續升高，胰酶的自水解加劇，酶活性損失加快。

 

     把酶液分別放置在 4℃、15℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中溫浴，每隔 20 min 檢測殘余酶活，得到 rPT 的熱穩定性曲線(xiàn)，如圖 2b 所示。4℃ 條件下 rPT 相對最穩定，2 小時(shí)內酶活殘余率在 97% 以上；隨著(zhù)溫度的升高，分子的結構發(fā)生了變化，分子間碰撞加劇，導致酶結構遭到破壞，rPT 的降解速率也隨之加快。50℃ 條件下 2 小時(shí)內酶活殘余還能達到 60% 左右；60℃ 條件下 2 小時(shí)內酶活殘余還能達到 10% 左右，而 70℃ 時(shí) 20 min 之內胰蛋白酶就會(huì )完全失活。

 

     3. 重組胰蛋白酶運輸條件下的穩定性

 

     試劑：

 

     1、重組胰蛋白酶凍干粉（批號：RPT1305001）

 

     2、測活緩沖液： 25 mmol 三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）緩沖液（pH7.6），含 100 mM NaCl,5 mM CaCL2。

 

     3、0.001M HCl：取稀釋至 1M 的 HCl, 稀釋 1000 倍即得，pH3-4。

 

     4、底物溶液（2.5 mmol/L）：精密稱(chēng)取 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）（Sigma）42.8 mg，加入相應 50 ml 體積的測活緩沖液，使其溶解，即為 2.5 mmol/L 的底物母液，現配現用, 使用時(shí)，用測活緩沖液 10 倍稀釋。

 

     5、供試品：精密稱(chēng)取待測樣品適量。平行分裝 3 支，置于藍冰保溫運輸箱內，室溫下放置。

 

     實(shí)驗方法：

 

     1、重組胰蛋白酶運輸條件下的穩定性：樣品測定活性，作為初始活性。藍冰于-20℃ 充分預冷后，取出，與樣品同時(shí)放入泡沫保溫運輸箱內，同時(shí)放入溫度記錄儀，2 日后，取出，測定活性，取平均值。以初始時(shí)酶活定為 100%，以殘余酶活百分比表示測定結果。

     實(shí)驗結果：

 

     運輸過(guò)程中的溫度變化曲線(xiàn)如圖 3 所示。

 

     結論：重組胰蛋白酶在藍冰保溫箱內保持低溫的條件下運輸穩定?；钚詿o(wú)損失，活性保持為 100%。