不同深度皮膚燙傷的動(dòng)物模型建立

      燒燙傷模型的研究主要采用熱水燙傷、 蒸汽燙傷等方法造成實(shí)驗動(dòng)物燙傷模型，這種造模方法常導致動(dòng)物皮膚創(chuàng )面邊緣不齊， 致傷物溫度受環(huán)境因素影響較大，燙傷面積和深度不易控制，重復性差， 對后續的實(shí)驗研究帶來(lái)許多不便。 因此， 建立標準化的燙傷動(dòng)物模型是燙傷研究中亟待解決的問(wèn)題。 我們利用燙傷儀，以大鼠和新西蘭兔為研究對象，系統探討燙傷溫度、時(shí)間、壓力等因素對燙傷深度的影響。

1.1 實(shí)驗動(dòng)物 

      68 只清潔級 SD 大鼠， 雄性，體質(zhì)量（ 280±10 ） g 上海斯萊克實(shí)驗動(dòng)物有限公司提供，許可證號： SCXK （滬） 2012-0002 。 46 只普通級新西蘭兔，雄性，體質(zhì)量（ 2300±100 ） g ，上海生旺實(shí)驗動(dòng)物養殖有限公司， 許可證號： SCXK （滬）2007-0007 。

1.2 儀器 

      大鼠燙傷模型的制備 實(shí)驗前將 SD 大鼠用10% 水合氯醛按 0.3 mL／100 g 腹腔注射麻醉。 麻醉后，大鼠背朝上，將背部?jì)蓚刃锠C傷的部位毛剃掉，用脫毛膏脫掉短毛，露出皮膚。 大鼠后肢背部左右兩側各設 1 個(gè)燙傷面， 超級控溫燙傷儀配套2 cm 2 燙頭通電后，燙頭設定為壓力： 0.5 kg ；溫度：80℃ ，時(shí)間 2 、 5 、 8 、 10 、 15 s ；溫度： 90℃ ，時(shí)間 5 、 8 、10 、 12 、 15 、 18 、 20 、 22 、 25 、 28 、 30 s ； 對大鼠背部標記部位進(jìn)行燙傷。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 4 只大鼠，同時(shí)設 1個(gè)空白對照組，燙后肉眼觀(guān)察燙傷面，通過(guò)不同的時(shí)間梯度來(lái)驗證燙傷深度。 燙傷后 24 h 切取燙傷處皮膚，常規 HE 染色，進(jìn)行皮膚病理檢查。

      新西蘭兔燙傷模型的制備 實(shí)驗前將新西蘭兔用戊巴比妥鈉按 30 mg／kg 耳緣靜脈注射，麻醉后，兔背朝上，將兔背部脊柱兩側需燙傷的部位毛剃掉，然后用脫毛膏脫掉短毛，露出皮膚。 兔背部左右兩側各設 2 個(gè)燙傷面， 超級控溫燙傷儀配套 4 cm 2 燙頭通電后，燙頭設定為壓力： 0.5 kg ；溫度： 80℃ ，時(shí)間 2 、 5 、 8 、 10 、 15 s ；溫度： 90℃ ，時(shí)間 5 、8 、 10 、 12 、 15 、 18 、 20 、 22 、 25 、 28 、 30 s ；溫度： 95℃ ，時(shí)間 25 、 30 、 35 、 40 、 45 、 50 s ；對兔子背部標記部位進(jìn)行不同時(shí)間梯度的燙傷。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn) 2 只兔子，同時(shí)設 1 個(gè)空白對照組，燙傷后肉眼觀(guān)察燙傷面。

病理檢查

      為驗證燙傷深度， 燙傷 24 h 后，取空白對照組和燙傷組創(chuàng )面皮膚，經(jīng)酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片， HE 染色，進(jìn)行皮膚病理檢查。 燙傷深度的判定按照三度四分法進(jìn)行劃分。根據燙傷所達到的深度、病理變化及臨床表現，劃分為： Ⅰ 度、淺 Ⅱ 度、深 Ⅱ 度、 Ⅲ 度燙傷。

      燙傷外觀(guān)檢查 大鼠皮膚在溫度 80℃ 、時(shí)間2～10 s ，家兔皮膚在溫度 80℃ 、時(shí)間 2～15 s 及溫度 90℃ 、時(shí)間 5 s 條件下，創(chuàng )面顏色微紅，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)顏色逐漸加深， 創(chuàng )面與周?chē)Ｆつw界限由不明顯到逐漸清晰，皮膚質(zhì)地較軟。 大鼠皮膚在溫度 80℃ 、 時(shí)間 15 s 及溫度 90℃ 、 時(shí)間 5～12s ，家兔皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 8～20 s 條件下，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)，創(chuàng )面顏色由紅色向局部白色轉變，創(chuàng )面與周?chē)Ｆつw有明顯的界限， 皮膚質(zhì)地由軟變硬。 大鼠皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 15～20 s ，家兔皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 22～30 s 條件下，隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)， 創(chuàng )面顏色由局部白色向全部呈微黃色轉變，創(chuàng )面與周?chē)Ｆつw界限明顯，皮膚質(zhì)地變硬并逐漸向外凸起。大鼠皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間22～30 s ，家兔皮膚在溫度 95℃ 、時(shí)間 25～50 s 條件下， 隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)創(chuàng )面顏色由淺黃色向焦黃色轉變，創(chuàng )面與周?chē)Ｆつw界限明顯，皮膚呈凝固狀。

      正常大鼠和家兔皮膚表皮、真皮及皮下組織排列整齊有序。大鼠皮膚在溫度 80℃ 、時(shí)間 2～10 s ，家兔皮膚在溫度 80℃ 、時(shí)間 2～15 s及溫度 90℃ 、時(shí)間 5 s 條件下，燙傷表皮呈凝固性壞死，表皮下水腫充血，炎性細胞浸潤，為 Ⅰ 度燙傷。 大鼠皮膚在溫度 80℃ 、時(shí)間 15 s 及溫度 90℃ 、時(shí)間 5～12 s ，家兔皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 8～20 s條件下，燙傷表皮壞死，部分脫落，真皮淺層膠原玻璃樣變性，皮膚附屬器部分凝固性壞死，為淺 Ⅱ度燙傷。 大鼠皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 15～20 s ，家兔皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 22～30 s 條件下，表皮壞死，部分脫落，真皮深層膠原變性，皮膚附屬器大部分壞死，為深 Ⅱ 度燙傷。大鼠皮膚在溫度 90℃ 、時(shí)間 22～30 s ，家兔皮膚在溫度 95℃ 、時(shí)間 25～50 s 條件下，表皮壞死，真皮全層膠原變性，皮膚附屬器壞死，皮下疏松結締組織充血水腫，炎性細胞浸潤，為 Ⅲ 度燙傷。

      本實(shí)驗使用的燙傷儀具有燙傷溫度、時(shí)間、壓力、創(chuàng )面面積可控的特點(diǎn)，制備的實(shí)驗動(dòng)物皮膚燙傷模型，燙傷深度可控，操作簡(jiǎn)便，重復性好，是建立不同深度燙傷模型比較理想的方法。 在實(shí)驗過(guò)程中，壓力控制在 0.5 kg 較為合適，壓力太大易造成動(dòng)物皮膚下陷， 創(chuàng )面易滑動(dòng)， 燙傷面積不易控制。 因此，本實(shí)驗燙傷壓力嚴格控制在 0.5 kg 。 在實(shí)驗創(chuàng )面位置的選取上， 應選靠近動(dòng)物脊柱兩側或后肢靠脊柱的部位，這些部位肌肉較多，較為平整，這樣致傷后形成的創(chuàng )面深度能保持相對一致。本實(shí)驗證明了燙傷深度與燙傷溫度和時(shí)間具有相關(guān)性， 燙傷深度隨著(zhù)溫度升高、 時(shí)間的延長(cháng)而加深。 本實(shí)驗我們篩選出的實(shí)驗大鼠和家兔不同深度燙傷的實(shí)驗條件， 可為今后的燙傷實(shí)驗研究提供實(shí)驗依據。

    40倍 三度燒傷

      急性腎損傷(AKI)是一種臨床常見(jiàn)的危重癥疾病,其起病急,病程進(jìn)展快,死亡率及病死率高,且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。AKI可由感染、燒傷、創(chuàng )傷、腎動(dòng)脈狹窄及休克等各種原因引起,其中膿毒血癥是臨床發(fā)生AKI的最重要原因之一。在膿毒血癥導致AKI的進(jìn)展過(guò)程中,內皮素- 1(ET- 1)及Rho /Rho激酶通路發(fā)揮重要作用。ET- 1是目前發(fā)現最強的縮血管物質(zhì),在膿毒血癥等病理情況下,ET- 1合成及釋放明顯升高,并與內皮素受體結合產(chǎn)生強大而持久的血管收縮效應,從而影響腎組織血液灌注,最終導致AKI。Rho/ Rho激酶是具有信號傳導和分子開(kāi)關(guān)作用的信號多肽,參與血管平滑肌收縮、細胞分化及細胞凋亡等多種細胞功能。鹽酸法舒地爾作為一種Rho激酶特異性抑制劑,通過(guò)阻斷Rho /Rho激酶具有擴血管、抗炎等廣泛的藥理作用。

   100倍 腎

2.3　標本的采集及檢測方法

腎臟病理檢查

      切片行HE染色觀(guān)察腎臟病理變化及腎小管損傷程度。腎小管損傷的分級:每張切片× 200倍鏡下取外髓質(zhì)部10個(gè)視野,按0是正常,1是輕微損傷(受損腎小管占總腎小管< 5%),2是輕度損傷(受損腎小管占總腎小管的5%～ 25%),3是中度損傷(受損腎小管占總腎小管的25%～ 75%),4是重度損傷(受損腎小管占總腎小管> 75%)作半定量分析并計算其均值,作為腎小管壞死的評分指數。

      基礎狀態(tài)觀(guān)察AKI模型組大鼠腹腔注射LPS后,出現呼吸明顯加快,精神萎靡,反應遲鈍,皮膚溫度明顯降低,少動(dòng),少食或拒食,尿量減少,尿色加深,個(gè)別動(dòng)物出現血尿。治療組大鼠的精神狀態(tài)及活動(dòng)好于模型組,但不如正常對照組。

腎臟組織病理學(xué)變化

      (1)AKI模型組可見(jiàn)腎臟體積增大,腎皮質(zhì)較蒼白,髓質(zhì)淤血,顏色深暗,腎小管由于嚴重缺血而發(fā)生壞死。光鏡下可見(jiàn)早期腎小球大致正常,腎小管上皮細胞腫脹、脂肪變性和空泡變性,晚期出現不同程度腎小管上皮細胞壞死,細胞核固縮、溶解、消失。壞死的腎小管上皮細胞脫落入管腔內,呈模糊的顆粒狀結構。遠端腎小管及集合管內可見(jiàn)小管周?chē)拈g質(zhì)充血、水腫及炎性細胞浸潤。(2)治療組光鏡下見(jiàn)部分腎小管上皮細胞輕度腫脹、少量變性與壞死,腎間質(zhì)無(wú)明顯改變及炎細胞浸潤。

      急性腎損傷是一種較常見(jiàn)的臨床重、危、急癥,可發(fā)生于醫院內、外、婦產(chǎn)、兒科等。感染導致的膿毒血癥是引起AKI最重要的因素之一。近期有資料報告,既便CRE很小(0.3mg dl)幅度的變化也會(huì )影響預后。本實(shí)驗結果顯示,腹腔注射LPS l h后,AKI模型組及治療組CRE、BUN濃度雖無(wú)明顯升高,但血清ET- 1水平及腎小管壞死評分值已有明顯增加,并與腎組織ROCK- Ⅰ表達升高的變化峰值時(shí)點(diǎn)相一致,提示在腹腔注射LPS后,ET- 1及ROCK- Ⅰ水平,即可引起腎組織的結構損傷,且可進(jìn)一步推測LPS可能通過(guò)激活Rho Rho激酶通路引起ET- 1的合成及釋放增加,進(jìn)而引起AKI。

  （本文轉載丁香園）