背景及原理:
細胞中存在著(zhù)能分解磷酸酯的酶,其中最主要的是磷酸酯酶。這類(lèi)酶按最適PH可分為兩類(lèi):1.PH在9.5左右的條件下發(fā)揮作用,稱(chēng)為堿性磷酸酶;另一類(lèi)在PH5.0左右的條件下發(fā)揮作用,稱(chēng)為酸性磷酸酶。當酸性磷酸酶與其底物作用時(shí),能水解磷酸酯使其釋放出磷酸基,磷酸基進(jìn)而與溶液中存在的鉛鹽結合形成無(wú)色的磷酸氫鉛沉淀物,當用黃色的硫酸銨作用該沉淀時(shí)可形成黃棕色或棕黑色的硫化鉛沉淀,從而確定細胞中酸性磷酸酶所處的部位。
酸性磷酸酶廣泛分布于集體各種組織細胞內,主要存在于細胞的溶酶體內,常作為溶酶體的標志酶,此外,還存在于內質(zhì)網(wǎng)和細胞質(zhì)內。當細胞中核算和蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)增加時(shí),酸性磷酸酶活性增強。酸性磷酸酶還參與脂類(lèi)代謝。因此,它在疾病、免疫反應和細胞損傷與修復過(guò)程中具有一定的生物學(xué)意義。
實(shí)驗方法與步驟:
1 取20g左右小白鼠一只,每日向其腹腔注射6%淀粉肉湯1ml,連續3d。
2 在第三次注射后4和,向腹腔注射生理鹽水1ml。
3 頸椎脫臼法處死小鼠后,打開(kāi)腹腔,用注射器(不裝針頭)直接吸取腹腔液。
4 向預冷的蓋玻片上滴一滴腹腔液,立即用牙簽圖后放入小培養皿4℃冰箱中30min,使細胞自行鋪展開(kāi)。
5 冷風(fēng)吹干玻片。
6 多聚甲醛固定30min。
7 PBS沖洗。
8 向蓋玻片上滴加酸性磷酸酶工作液,37℃,30min。
9 蒸餾水洗凈,吸去多余水分。
10 放入2%硫化銨溶液中處理5min,蒸餾水洗凈。
11 封片
12 鏡檢。
13 對照實(shí)驗:將腹腔涂片置50℃溫育30min使酶滅活,再進(jìn)行6-12步同樣的實(shí)驗。
附錄
以新鮮動(dòng)物組織為材料對細胞中酸性磷酸酶的定位
實(shí)驗方法與步驟:
1 、動(dòng)物新鮮組織低溫恒冷切片,片厚6μm,冷丙酮固定10min。
2、 把切片置于酸性磷酸酶工作液中(預熱至37℃),37℃處理0.5-1h。
3 、蒸餾水洗3次,每次1min。
4 、1%冰乙酸液處理3min。
5 、蒸餾水浸洗2次,每次1min。
6、 2%硫化銨液處理3-5min。
7 、流水沖洗數分鐘,蒸餾水洗3遍。
8、 用1:30的吉姆薩染液染色15min。
9、 封片
10、 鏡檢
注意事項:
1 孵育液必須現配先用。
2 當鉛離子濃度過(guò)低時(shí),產(chǎn)生的磷酸離子不能完全被結合而發(fā)生彌散,并可進(jìn)入細胞核,會(huì )造成染色假陽(yáng)性。
3 孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)也可能發(fā)生酶擴散和細胞核染色現象。
(本文轉載丁香園)