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清醒動(dòng)物大腦神經(jīng)遞質(zhì)的提取和在線(xiàn)檢測分析

發(fā)布人：admin 瀏覽次數：1689 發(fā)布時(shí)間：2017-08-03

 

微透析技術(shù)基本原理

      1微透析技術(shù)是一種在體微量化學(xué)采樣與檢測技術(shù)，由西班牙之 Delgado 及瑞典之 Ungerstedt 等人于 1972 年自更早的壓抽導管（push-pull cannula）改進(jìn)而來(lái)。


      基本原理：選擇具有一定截留分子量的纖維半透膜制成的探針埋入待測的組織區域，以恒定速度向探頭內灌注與組織液成分相近的等滲灌流液，當灌流液流經(jīng)探頭前端透析膜時(shí)，組織內小分子量生物活性物質(zhì)即順濃度梯度從膜外擴散入膜內，并隨灌流液被引流至探針外，按一定的時(shí)間間隔連續收集透析液，檢測其中待測生物活性物質(zhì)水平，可監測該區域內細胞外生物活性物質(zhì)濃度的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程。

 

微透析技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢

      ★ 空間分辨性高，樣品即取即測，可代表取樣位點(diǎn)目標化合物的濃度；

 

      ★ 細胞外液采樣，真實(shí)反映目標化合物的濃度水平；

 

      ★ 透析樣品不需預處理，樣品中不含蛋白質(zhì)、酶等大分子物質(zhì)，可直接測定；

     

      ★ 活體采樣，維持機體的完整性，接近生理狀態(tài)，減少實(shí)驗動(dòng)物數量；

 

      ★ 連續采樣，可獲得藥物代謝中間過(guò)程的信息；

      ★ 同一生物個(gè)體，避免因體液量損失對藥物分布及消除的影響；

     

      ★ 樣品體積恒定，樣品中各成分濃度基本不變，膜對藥物的非特異性吸附少；

 

      ★ 損傷小，微創(chuàng )，可在清醒、自由活動(dòng)的動(dòng)物上連續取樣，且動(dòng)物本身自成空白對照。

 

動(dòng)物大腦微透析實(shí)驗
 
A. 動(dòng)物麻醉、腦區定位

 

      主要包括

      1-異氟烷（R510-22）

      2-空氣泵（R510-29）

      3-小動(dòng)物麻醉機（R540IE）

      4-腦立體定位儀（68025）
 
      5-定位儀專(zhuān)用麻醉/回收面罩（68666）

      6-麻醉誘導盒（V101）

      7-氣體過(guò)濾罐（R510-31）

      8-氣體回收器（R546W）
 

B. 大腦手術(shù)和動(dòng)物護理

 

C. 微透析-高效液相-電化學(xué)在線(xiàn)檢測分析 

 

      1-微透析泵（ESP-64）

      2-微量注射器（LTN 1002）

      3-清醒活動(dòng)裝置（TSU-20）

      4-清醒活動(dòng)籠（BC-80）

      5-微透析探針（C-I-X-Y）

      6-管路（JT-10-100）

       7-管路接頭（JB-30）

      8-在線(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣器（EAS-20s）

      9-HPLC-ECD 一體式檢測分析系統（HTEC-510）

     10-工作站（EPC-710）

     11-耗材（分離柱等）
 

操作步驟

 

1、動(dòng)物準備

    （1）動(dòng)物麻醉與固定

    （2）備皮

    （3）暴露顱骨
 
    （4）定位調節

    （5）定位鉆孔

 

2、植入探針導管

    （1）植入螺絲

    （2）植入導管
 
    （3）牙科水泥固定

    （4）傷口縫合

    （5）動(dòng)物恢復

3、開(kāi)始透析和在線(xiàn)檢測……

    （1）微透析-HPLC-ECD 安裝和測試

    （2）微透析探針的準備

    （3）灌流液的準備

    （4）植入微透析探針
 

4、管路和探針的清潔和保養

    （1）探針：透析結束后，應立即取出探針，用導管帽插入導管封閉。取出的探針置于雙蒸水中，用雙蒸水在 1-2ul/min 的速度下沖洗過(guò)夜（保持原管路的連接一起沖洗），充分排盡整個(gè)管路及探針中的鹽分，然后取下探針，置于新鮮雙蒸水中保持濕潤狀態(tài)，于 4℃ 冰箱中保存（目的是防止探針膜收縮）。

    （2）轉環(huán)：在上述雙蒸水過(guò)夜沖洗完成后，再用 100% 丙酮以 1-2ul/min 的速度沖洗約 1 個(gè)小時(shí)（切忌使用次氯酸沖洗），之后自然晾干，密封其出入口，置于低溫條件保存，否則易長(cháng)菌，導致后續微透析時(shí)回收率降低。

    （3）管路：在第（1）步完成后，用次氯酸沖洗約 0.5 個(gè)小時(shí)，然后再用雙蒸水沖洗約 1 個(gè)小時(shí)，清除殘留的次氯酸，之后密封其出入口，置于低溫條件保存，否則易長(cháng)菌，導致后續微透析時(shí)回收率降低。
 

5、回收率的測定（體外）

      在 aCSF 液中加入所要透析的目標物的標準物品（已知濃度），將探針置于此溶液中，在相同灌流速度（Ringer's 液）、相同外界溫度的條件下進(jìn)行透析，收集透析出來(lái)的樣品，測定目標物的的濃度，從而可得此條件下該探針的相對回收率。

      影響回收率的因素：

      ◆ 目標物的特性，如分子量大小、溶解性

      ◆ 微透析膜的特性，如材質(zhì)、孔徑、長(cháng)度（0.5-10 mm）◆ 灌流速度，一般為 0.5-5ul/min，一般在 30-60 min 后開(kāi)始收集◆ 灌流液的化學(xué)成分、PH 值等……
 
注意事項
 
      微透析實(shí)驗與許多實(shí)驗不同，很多方面取決于操作者的技能水平，特別值得注意的有以下幾點(diǎn)：

      1、埋置探針的位置（AP、ML、DV 值）要準確，選擇合適的探針膜長(cháng)，一般來(lái)說(shuō)，在目標部位縱向跨度范圍內，膜長(cháng)選擇越長(cháng)，回收率越高；

 

      2、探針操作時(shí)，需要特別細心，避免探針膜的損壞，從而延長(cháng)探針的壽命和使用次數；

 

      3、探針使用前的預處理，以及在使用間隔期間的處理、沖洗、浸泡，目的也是延長(cháng)探針的壽命和使用次數；

 

      4、連接管路時(shí)，需仔細檢查，防止漏液和堵塞，同時(shí)也要防止連接管和接頭的損壞。

      MD-HPLC-ECD 在線(xiàn)檢測分析應用舉例
 

微透析-HPLC-ECD 在線(xiàn)檢測分析的優(yōu)勢：

      ★ 動(dòng)物麻醉和清醒狀態(tài)取樣；
 
      ★ 定點(diǎn)連續取樣；

      ★ 適用于腦部、脊髓神經(jīng)、血液、肌肉以及各種軟組織取樣等；

     

      ★取樣過(guò)程不破壞動(dòng)物機體完整性；

      ★ 可透析分析神經(jīng)遞質(zhì)、單胺類(lèi)物質(zhì)、氨基酸和能量代謝物等；

    

      ★ 可利用微透析進(jìn)行緩解給藥；

      ★ 樣品純凈度高，不含蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)；

      ★ 極小的采樣量即可進(jìn)行定量檢測；

      ★ 檢測精度高，可達到 fmol、pg 級別；

      ★ 樣品采集，檢測過(guò)程可實(shí)現自動(dòng)化。

     

     (本文轉載丁香通）


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