實(shí)驗方法原理

    PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、靈敏地從總 RNA 中分析特異 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾長(cháng)度。這方法中，包括 cDNA 合成的整個(gè)操作過(guò)程都在一個(gè)反應管中完成，不僅操作更簡(jiǎn)便，也減少了可能存在的 RNase 污染。尤其是 PAT cDNA 合成后非常穩定，并可重復使用，該方法的易操作性及靈敏度使其可以在任何系統中分析 poly(A) 尾的長(cháng)度，目前已成功應用于鼠卵母細胞、果蠅卵母細胞和肝胎、線(xiàn)蟲(chóng)、酵母及培養細胞中 poly(A) 的分析。

實(shí)驗材料

    T4 DNA連接酶   無(wú) RNase H SuperscriptⅡ反轉錄酶   寡聚(dT)錨引物   mRNA特異引物

試劑、試劑盒
      

    蒸餾水   Superscript Ⅱ RT緩沖液   DTT   ATP   dNTP   Taq DNA聚合酶   Taq DNA聚合酶緩沖液

實(shí)驗步驟

一、材料與設備

    1. PAT cDNA 制備

    (1) DEPC 處理蒸餾水。

    (2) DNA 連接酶（10 Weiss U/L）。

    (3) 無(wú) RNase H Superscript Ⅱ 反轉錄酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。

    (4) 5 X Superscript Ⅱ RT 緩沖液。

    (5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。

    (6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。

    (7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H2O 配制。

    (8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必須被磷酸化 ]，10 ng/μl。

    (9) 寡聚（dT ) 錨引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作為 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。

    2. PCR 反應

    (1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。

    (2) 寡聚（dT ) 錨引物 200 ng/μl 水配制。

    (3) mRNA 特異引物，溶于蒸餾水。

    (4) Taq DNA 聚合酶。

    (5) 10X Taq DNA 聚合酶緩沖液。

二、操作方法

    1. PAT cDNA 制備

    (1) 從組織或細胞中提取總 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入無(wú) RNase 的微量離心管中。

    (2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每個(gè) RNA 樣品中，RNA 和 p[dT]12-18 的總體積為 7 μl。

    (3) 加熱到 65℃，變性 5~10 min。

    (4) 立即將反應管置于 42°C 水浴中，注意動(dòng)作要迅速，以避免 p[dT]12-18 與最未端 poly(A) 尾退火。

    (5) 加入 13 μl 預熱至 42°C 的 下列混合物，用吸頭吹打混勻，置 42℃ 孵育 30 min。對于所有 PAT 反應，預先混合所有相同組分，對于每一個(gè)反應，應加入：4 μl 5X Superscript II RT 緩沖液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 處理水，1 μl T4 DNA 連接酶 10 Weiss U/μl。

    (6) 孵育后，反成物仍保溫于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 錨引物?；靹?，快速離心，12℃ 孵育 2 h。

    (7) 將反應管置于 42℃ 孵育 2min。

    (8) 加入 1 μl 無(wú) RNase H Superscript II 反轉錄酶，混勻，置于 42°C 孵育 1 h。

    (9) 加熱 20 min，使反轉錄酶和連接酶失活，PAT cDNA 可根據需要進(jìn)行稀釋。

    2. PCR 反應

    (1) 25~50 μl 標準反應體系包括：1X 緩沖液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 時(shí) pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2 ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特異引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 錨引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作為模板。

    (2) 擴增 500 bp 長(cháng)片段建議使用的循環(huán)條件：93°C 變性 5 min，93°C 變件 30 s，57~65°C 復性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。

    (3) 可以取一小部分擴增產(chǎn)物，利用限制性?xún)惹泻怂崦竿耆治?3' 末端。

    (4) 用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物。

     (本文轉載丁香園）