【原理】

      RNA的制備與分析對于了解基因表達在轉錄水平上的調節是必不可少的，也是最常使用的通過(guò)cDNA途徑分析細胞基因表達的前提。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數真核細胞mRNA的3’末端都帶有一段較長(cháng)的多腺苷酸鏈。這個(gè)群體編碼了所有由該細胞合成的多肽。RNA分析其實(shí)是對組織細胞總RNA中的mRNA進(jìn)行分析。最常用的方法主要有:原位雜交、RT-PCR、Northern ，另外還有: Sl 核酸酶作圖分析、引物延伸法等。在所有RNA實(shí)驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(cháng)的RNA。而實(shí)驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì )引起RNA在制備與分析過(guò)程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實(shí)驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其他分子生物學(xué)實(shí)驗中使用的RNA酶也會(huì )造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量?jì)仍葱缘腞NA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

      1．所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(cháng)時(shí)間。

      2．塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用)。

      3．有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。

      4．配制的溶液應盡可能用0.1% DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng) 濾膜過(guò)濾除菌。

      5．操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗過(guò)程中手套要勤換。

      6．設置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗室，所有器械等應為專(zhuān)用。

二、常用的RNA酶抑制劑

      1．焦磷酸二乙酯  是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團組氨酸的瞇唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

      2．異硫氰酸胍  目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來(lái)，又對RNA酶有強烈的變性作用。

      3．氧釩核糖核昔復合物由氧化釩離子和核昔形成的復合物，它和RNA酶結合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

      4．RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin)  從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

      5．其他  SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

一、組織和細胞總RNA提取―異硫氰酸胍法

      1.培養細胞  收集細胞1～2×10⁷ ，離心，5000g×5min。對于貼壁培養細胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細胞并轉移至1Od離心管中；懸浮培養細胞可直接轉移離心管；離心， 5000g×5mim PBS洗滌2次。棄上清，置冰浴。加預冷變性液2ml，充分搖動(dòng)，使細胞裂解完全。以下操作均在冰浴中進(jìn)行。

      2.組織  取1～2g組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置組織勻漿器中，加入預冷的變性液12ml，在冰浴中充分勻漿。

二、總RNA定量

      RNA定量方法與DNA定量相似RNA在260nm波長(cháng)處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長(cháng)分光測定RNA濃度，OD值為1相當于大約40μg/ml 的單鏈RNA。如用1cm光徑，用雙蒸水稀釋RNA樣品n倍并以雙蒸水為空白對照，根據此時(shí)讀出的OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度: RNA (mg/ml) = 40×OD260 讀數×稀釋倍數(n)/1000。RNA純品的OD260 /OD280 的比值為2.0，故根據OD260 /OD280 的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。

  （本文轉載丁香園）