利用 RNA 模板通過(guò)反轉錄獲得 DNA,進(jìn)而復制和感染細胞

實(shí)驗材料
      poly(A)+RNA   反轉錄酶   鼠源反轉酶 或禽源反轉錄酶

試劑、試劑盒
      oligo(dT)12-18   lmol LTris-Cl   1mol LTris-Cl   lmol LKC1   25 mmol LMgCl2   dNTP 混合物   0.lmol LDTT   RNasin


實(shí)驗步驟
一材料與設備


      1)poly(A)+RNA,lmg/ml


      2)oligo(dT)12-18,lmg/ml


      3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。


      4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)


      5)lmol/LKC1


      6)25 mmol/LMgCl2


      7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L


      8)0.lmol/LDTT


      9)RNasin。


      10) 反轉錄酶，鼠源反轉酶 (Pharmacia 公司，200U/ul) 或禽源反轉錄酶（20U/ul)

二、操作方法

(一) 使用鼠源反轉錄酶合成 cDNA


       1) 在滅菌微量離心管中混合下列物質(zhì)，并置于冰上:


        Poly(A)+4RNA,lmg/ml                                          10ul


        oligo(dT)12-18,lmg/ml                                         10ul
 
 
         lmol/LTris-Cl(pH7.6)                                            2.5ul


         lmol/LKC1                                                          3.5ul


         250 mmol/LMgCl2                                               2ul


         dNTP 混合物，各 5 mmol/L                                 10ul


         0.lmol/LDTT                                                       2ul


         RNasin                                                              25U


         鼠源反轉錄酶                                                    200U


         加水至總體積為                                                 50ul


        2) 于 37°C 反應 lh


        3) 純化回收. 保存于一 20℃


(二）使用禽源反轉錄酶合成 cDNA
 
        1) 在火菌微量離心管中混合下列物質(zhì)，井置于冰上:

         poly(A)+RNA,lmg/ml                                             10ul


         oligo(dT)12-18,lmg/ml                                           10u1


         lmol/LTris-Cl(pH8.3)                                              2.5uI


         lmol/LKC1                                                            3.5ul


         250 mmol/LMgCI2                                                 2ul
 
 
         dNTP 混合物，各 3 mmol/L                                    10ul


         0.lmol/LDTT                                                          2ul


         RNasin                                                                  25U
 
 
         禽源反轉斌酶                                                         40U
 
 
         加水至總體積為                                                     50ul

        2) 于 42℃ 反應 lh

        3) 純化冋收，保存于一 20℃
 
注意事項
      1) 可以先進(jìn)行小規模的預實(shí)驗以確定反轉錄酶的用量。
 
      2) 在反應中加入 [α32P]dCTP，可以通過(guò)放射性自顯影檢測反轉錄的質(zhì)量和產(chǎn)率

      3) 對于具有不利于轉錄反應的二級結構的 mRNA 的轉錄，使用最適溫度為 42℃ 的禽源反轉錄酶可能取得較好的結果。

      4）除使用 oligo(dt)12-18 外，在反轉錄反府中也可以使用長(cháng)度為 6 的隨機寡聚核苷酸。
 
      5) 隨若基因芯片技術(shù)的發(fā)展和逐漸普及應用，產(chǎn)生了由 mRNA 反轉彔而獲得熒光標記 cDNA 探針的方法。與常用的 RNA 探針同位素標記不同之處就在于其加入了熒光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素標記的 dNTP。

     （本文轉載丁香園）