利用 RNA 模板通過(guò)反轉錄獲得 DNA,進(jìn)而復制和感染細胞
實(shí)驗材料
poly(A)+RNA 反轉錄酶 鼠源反轉酶 或禽源反轉錄酶
試劑、試劑盒
oligo(dT)12-18 lmol LTris-Cl 1mol LTris-Cl lmol LKC1 25 mmol LMgCl2 dNTP 混合物 0.lmol LDTT RNasin
實(shí)驗步驟
一材料與設備
1)poly(A)+RNA,lmg/ml
2)oligo(dT)12-18,lmg/ml
3)lmol/LTris-Cl(pH7.6)。
4)1mol/LTris-Cl(pH8.3)
5)lmol/LKC1
6)25 mmol/LMgCl2
7)dNTP 混合物,各 5 mmol/L
8)0.lmol/LDTT
9)RNasin。
10) 反轉錄酶,鼠源反轉酶 (Pharmacia 公司,200U/ul) 或禽源反轉錄酶(20U/ul)
二、操作方法
(一) 使用鼠源反轉錄酶合成 cDNA
1) 在滅菌微量離心管中混合下列物質(zhì),并置于冰上:
Poly(A)+4RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10ul
lmol/LTris-Cl(pH7.6) 2.5ul
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCl2 2ul
dNTP 混合物,各 5 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
鼠源反轉錄酶 200U
加水至總體積為 50ul
2) 于 37°C 反應 lh
3) 純化回收. 保存于一 20℃
(二)使用禽源反轉錄酶合成 cDNA
1) 在火菌微量離心管中混合下列物質(zhì),井置于冰上:
poly(A)+RNA,lmg/ml 10ul
oligo(dT)12-18,lmg/ml 10u1
lmol/LTris-Cl(pH8.3) 2.5uI
lmol/LKC1 3.5ul
250 mmol/LMgCI2 2ul
dNTP 混合物,各 3 mmol/L 10ul
0.lmol/LDTT 2ul
RNasin 25U
禽源反轉斌酶 40U
加水至總體積為 50ul
2) 于 42℃ 反應 lh
3) 純化冋收,保存于一 20℃
注意事項
1) 可以先進(jìn)行小規模的預實(shí)驗以確定反轉錄酶的用量。
2) 在反應中加入 [α32P]dCTP,可以通過(guò)放射性自顯影檢測反轉錄的質(zhì)量和產(chǎn)率
3) 對于具有不利于轉錄反應的二級結構的 mRNA 的轉錄,使用最適溫度為 42℃ 的禽源反轉錄酶可能取得較好的結果。
4)除使用 oligo(dt)12-18 外,在反轉錄反府中也可以使用長(cháng)度為 6 的隨機寡聚核苷酸。
5) 隨若基因芯片技術(shù)的發(fā)展和逐漸普及應用,產(chǎn)生了由 mRNA 反轉彔而獲得熒光標記 cDNA 探針的方法。與常用的 RNA 探針同位素標記不同之處就在于其加入了熒光染料 Cy3 或 Cy5 代替了冋位素標記的 dNTP。
(本文轉載丁香園)