ELISPOT 技術(shù)簡(jiǎn)介
 
      隨著(zhù)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據 ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內外廣泛應用，對探索自身免疫系統疾病發(fā)病機制具有重要意義。

      ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統 ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于：

      ELISA 通過(guò)顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線(xiàn)比較得出可溶性蛋白總量。

      ELISPOT 也是通過(guò)顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計數斑點(diǎn)或通過(guò) CTL 公司的 ELISPOT 分析系統對斑點(diǎn)進(jìn)行計數， 1 個(gè)斑點(diǎn)代表 1 個(gè)細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬(wàn) -30 萬(wàn)細胞中檢出 1 個(gè)分泌該蛋白的細胞。

      捕獲抗體為 BD 、 R&D 、 Mabtech 、 Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時(shí)，不會(huì )影響活化細胞分泌細胞因子。

ELISPOT 檢測原理

      細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現“紫色”的斑點(diǎn)表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過(guò) CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統對斑點(diǎn)的分析后得出結果。
 
       ELISPOT 分析儀的出現解決了以下問(wèn)題

      哪些斑點(diǎn)是抗原特異性 T 細胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)具有進(jìn)一步分析價(jià)值），哪些是無(wú)關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點(diǎn)沒(méi)有 T 細胞研究?jì)r(jià)值）斑點(diǎn)大小的意義

      在對不同細胞因子計數和分析時(shí)，如何定義斑點(diǎn)最大和最小尺寸

      如何從單個(gè)細胞基礎上分析

      實(shí)驗精確度有多高？如果一個(gè)細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會(huì )干擾分析結果？

      幾次重復實(shí)驗才能使結果更有意義？

      （本文轉載丁香園）