Eli-spot 方法
發(fā)布人：admin
瀏覽次數：1228
發(fā)布時(shí)間：2017-10-12
1 預期用途
Eli-spot分析是設計用于在單細胞懸液中計數分泌細胞因子的細胞數量的方法。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于只需在體外進(jìn)行很少的處理從而使細胞因子產(chǎn)生的分析盡可能接近于體內狀況。這個(gè)技術(shù)用于測定在給予一定刺激的情況下細胞因子產(chǎn)生細胞的數目，以及在某種處理或病理條件下的細胞因子產(chǎn)生細胞的數量。
2 主要原理
細胞刺激后，原位產(chǎn)生的細胞因子被一種特異的單抗捕獲，在細胞溶解后，捕獲的細胞因子與第二種生物素化的檢測性抗體結合，后者進(jìn)一步通過(guò)與連接堿性磷酸酶的鏈親和素結合被識別。PVDF包被孔的板之后與BCIP/NBT底物作用，紫色的斑點(diǎn)提示單個(gè)細胞產(chǎn)生的細胞因子。
3 5×96孔試劑盒的內容物
▲ 捕獲抗體（0.52ml），置于4℃。
▲ 生物素化檢測抗體（凍干，重懸于0.55ml水中）。
▲ 抗生物素蛋白鏈霉素-堿性磷酸酶結合物，置于4℃。
▲ 牛血清白蛋白（1g），置于4℃。
▲ 撇去的干牛奶（1g），放于室溫。
▲ 備用底物溶液（50ml），置于4℃。
▲ 96孔PVDF包被板。
▲ 96孔PVDF-包被板
▲ 細胞培養基
▲ CO2孵箱
▲ 70%乙醇
▲ Tween20
▲ 堿性磷酸鹽緩沖液
5 直接或間接Eli-spot
細胞可以在抗體包被孔中直接刺激（直接）或者首先在24孔板或細頸瓶中刺激，收獲，然后種于包被孔中（間接）。
方法根據：1）被分析的細胞類(lèi)型；2）預期的細胞密度。如果細胞因子產(chǎn)生細胞的數量很少，建議用直接法實(shí)驗，但是如果細胞因子產(chǎn)生細胞的數量很多，最好用間接的方法。無(wú)論采用直接或間接的方法，所有刺激以后的步驟是相同的。
主要步驟：
1） 96孔PVDF板首先以70%乙醇處理，然后以捕獲抗體包被。
2） 將細胞放入抗體包被過(guò)的含有抗原/絲裂原的微孔中，在間接法中細胞被預刺激。
3） 細胞用倒置平板法去除，與生物素標記的抗體共育。
4） 與結合于堿性磷酸鹽的鏈霉親和素反應。
5） BCIP/NTB斑點(diǎn)形成。
◆刺激步驟：
小鼠脾細胞在PMA和lonomycin刺激下產(chǎn)生IFN-γ。人的IFN-γ由PBMC在PMA和lonomycin的刺激下產(chǎn)生。
建議步驟：
小鼠 1）分離脾細胞，ficoll。間期收獲細胞。用PBS洗三次，去除ficoll。2）用培養基稀釋細胞（RPMI1640含2mM L_glutamine,10%滅活的胎牛血清）含1ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）細胞到抗體包被的PVDF包被板，在孵箱中培養10—15小時(shí)。對于其它刺激物孵育時(shí)間可能不同，根據細胞因子產(chǎn)生細胞的密度，優(yōu)化條件。
人用培養基稀釋細胞（RPMI1640含2mM L_glutamine,10%滅活的胎牛血清）含1ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin(Sigma),加2×10（4）—5×10（4）細胞到抗體包被的PVDF包被板，在孵箱中培養10—15小時(shí)。對于其它刺激物孵育時(shí)間可能不同，根據細胞因子產(chǎn)生細胞的密度，優(yōu)化條件。
●試劑準備
● 檢測抗體 用0.55ml蒸餾水溶解凍干抗體，輕輕混勻溶液并等到所有凍干抗體溶解。
● 抗生物素蛋白鏈霉素-堿性磷酸酶 用含1%BSA的PBS稀釋?zhuān)?/1000）
● 堿性磷酸鹽緩沖液（10×濃縮液）1L溶液：80g NaCL；2g KH2PO4; 14.4g Na2HPO42H2O; 2g KCL，加蒸餾水至1升。檢查PH在7.2-7.4之間，此溶液在用之前稀釋為1×溶液。
● 含2%脫脂干奶粉的PBS 一塊板溶0.2g 干粉于10ml 1×PBS。
● 含1%BSA的PBS一塊板溶0.2g 干粉于20ml 1×PBS。
● 含0.1%Tween 的PBS一塊板溶100μlTween20于100ml 1×PBS。
● 70%乙醇一塊板以3ml蒸餾水和7ml 乙醇混勻。
★試劑保存
1） 如果短時(shí)間內不用，溶解的檢測抗體應分裝和保存于—20℃，在這種條件下，試劑可穩定保存至少一年。
2） 底物緩沖液保存于4℃。
3） 鏈霉親和素-堿性磷酸酶保存于4℃。
Eli-spot步驟
1 PVDF包被板用100ul 70%乙醇室溫下處理10分鐘。
2 倒空孔并以100ul PBS洗3次。
3 將100ul捕獲抗體加到10ml PBS中，混合并分至每孔中100ul，蓋上板蓋，放至4℃過(guò)夜。
4 倒空每孔，用100ul PBS洗一次。
5 每孔加100ul含2%脫脂干牛奶的PBS，蓋板，室溫2小時(shí)。
6 在洗滌槽上輕彈板子倒空液體，并在吸水紙上吸干。
7 用PBS洗一次。
8 分配每孔100ul細胞懸液（含合適的細胞數和合適的刺激物濃度），細胞可以在體外預刺激（間接Eli-spot）。蓋上板，放細胞于37℃CO2孵箱，合適的時(shí)間15-20小時(shí)。（在此期間不要搖動(dòng)或平移平板。）
9 在洗滌槽上輕彈板子倒空液體，并在吸水紙上吸干。
10 每孔加100ul含0.1%Tween20的PBS，4℃放置10分鐘。
11 用含0.1%Tween20的PBS洗板三次。
12 每一塊板，稀釋100ul檢測抗體到10ml 含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封閉扳子放于37℃1小時(shí)30分鐘。
13 倒空扳子并用含0.1%Tween20的PBS洗三次。
14 每一塊板，稀釋10ul鏈霉親和素-堿性磷酸酶復合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100ul，封閉扳子放于37℃1小時(shí)。
15 倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗三遍，反復用吸水紙吸以去盡所有殘存的液體。
16 每孔加100ul備用BCIP/NBT溶液。
17 讓反應在室溫進(jìn)行5-20分鐘。肉眼可見(jiàn)小斑點(diǎn)形成。
18 用蒸餾水洗三次。
19 干燥每孔。計數斑點(diǎn)。注意斑點(diǎn)在4℃過(guò)夜后可能會(huì )變得明顯，放置扳子于室溫，避免直接光照。
（本文轉載丁香園）
