免疫標記技術(shù)（immunolabelling techniques）是指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)（或生物）發(fā)光劑作為示蹤物，標記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應，借助于熒光顯微鏡、酶標檢測儀等儀器，對實(shí)驗結果直接鏡檢觀(guān)察或進(jìn)行自動(dòng)化測定，可在細胞、亞細胞以及分子水平上，對抗原抗體反應進(jìn)行定性和定位研究；或應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性定量測定。根據標記物的種類(lèi)和檢測方法不同，免疫標記技術(shù)可分為酶免疫的技術(shù)（以酶聯(lián)免疫吸附試驗為常用）、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫測定技術(shù)等，本節主要介紹酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)。
　　

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）
         酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是將抗原抗體反應的特異性和酶的高效催化作用相結合而發(fā)展起來(lái)的一種免疫標記技術(shù)，既可用于組織、細胞內抗原的檢測，又可用于體液中抗原抗體的檢測。根據檢測方法的不同，可將酶聯(lián)法分為雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法和其他ELISA，現介紹前三種。

    1.雙抗體夾心法　雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，將已知抗體包被于微孔條上，加入待檢品（抗原）形成抗原抗體復合物，加酶標抗體與之結合，經(jīng)顯色后用酶標儀測定OD值，從而測定相應抗原含量。
      （1）以pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋已知抗體包被酶標板，4℃過(guò)夜。市售商品往往已經(jīng)預先包被好已知抗體。
      （2）將酶標板、試劑等平衡至室溫，分別于相應孔內加入待檢樣品、陰性對照、陽(yáng)性對照50μl。
      （3）分別在每孔內滴加酶標抗體50μl。置37℃溫育60min。室溫平衡5min，甩干孔內液體，洗液洗滌5次，拍干。
      （4）每孔加顯色劑，37℃避光溫育10min。
      （5）每孔加終止液50μl，輕拍混勻。
      （6）酶標儀測定OD值，用空白調零。樣本OD值/陰性OD值（S/N）≥2.1（同時(shí)待檢杯OD＞0．10）判為陽(yáng)性。
 

         2. 間接法　間接法是檢測抗體最常用的方法， 將已知抗原吸附于固相載體，加待檢血清（抗體）形成抗原抗體復合物，經(jīng)孵育、洗滌后，加酶標抗體使之與抗原抗體復合物結合，經(jīng)顯色后用酶標儀測定OD值，從而間接測定相應抗體含量。步驟如下：
      （1）以pH 9.6碳酸鹽緩沖液稀釋已知抗原包被酶標板，4℃過(guò)夜。市售商品往往已經(jīng)預先包被好已知抗原。
      （2）在預包被已知抗原酶標板內加入待檢樣品、陰性對照、陽(yáng)性對照50μl。置37℃溫育25～45 min。用洗液洗滌5次，拍干。
      （3）分別在每孔內滴加酶標抗體100 μl。置37℃溫育25～30min，洗滌。
      （4）每孔加顯色劑，輕拍混勻，37℃避光溫育10min。
      （5）每孔加終止液50μl。
      （6）酶標儀測定OD值，用空白調零。樣本OD值/陰性OD值（S/N）≥2．1（同時(shí)待檢杯OD＞0．10）判為陽(yáng)性。

          3. 競爭法　競爭法既可用于抗原半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以抗原競爭法為例，將已知抗體吸附于固相載體，加一定量已知酶標抗原及待測抗原，使兩者競爭與固相抗體結合，經(jīng)洗滌，最后結合于固相抗體上的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關(guān)。步驟如下：
      （1）已知抗體包被酶標板，4℃過(guò)夜。
      （2）測定管內加一定量酶標抗原和待檢樣品，對照管內只加相同量酶標抗原。溫育，洗滌。
      （3）分別于測定管、對照管內加一定量底物顯色。
      （4）用酶標儀測定對照管、測定管內OD值，用空白調零。通過(guò)對照管與測定管OD值之差，計算標本中待測抗原含量。
 

         進(jìn)行ELISA操作時(shí)應注意以下幾點(diǎn)：①實(shí)驗室溫度應控制在18℃～25℃；②加樣須準確，同一樣本設立對照管、測定管各兩孔，取其平均值；③嚴格控制溫育反應溫度及時(shí)間，洗滌應充分；④結果判定應以?xún)x器為準，肉眼僅作參考。
  

二、免疫熒光技術(shù)
          免疫熒光技術(shù)是將熒光素如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)與相應抗體（或抗原）以化學(xué)的方法結合，將熒光標記抗體（或抗原）與標本中相應的抗原結合形成熒光標記的抗體-抗原復合物，用熒光顯微鏡觀(guān)察。在鏡下見(jiàn)到有熒光存在即推斷有抗原抗體復合物的存在，根據已知的抗體（或抗原）即可推知另一個(gè)未知抗原（或抗體）的存在。

         1. 直接免疫熒光法　直接免疫熒光法是利用熒光色素標記的特異性抗體直接與相應的抗原結合，以鑒定未知抗原。本法具有操作簡(jiǎn)單、時(shí)程短、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，但也存在缺點(diǎn)如不能檢查抗體，敏感性較差。
      （1）在標本上滴加熒光素標記抗體，放入濕盒中。37℃溫育30min。 
      （2）PBS沖洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。
      （3）PBS浸泡1～2min，風(fēng)干。
      （4）緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀(guān)察。
 

         進(jìn)行直接免疫熒光法時(shí)應注意：①溫育時(shí)一定要將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。②用PBS浸泡時(shí)應不斷振蕩。 
  

         2. 間接免疫熒光法　間接免疫熒光法以熒光素標記抗球蛋白抗體，抗體與相應抗原結合后，熒光標記的抗球蛋白抗體與已結合的抗體發(fā)生作用，從而推知抗原或抗體的存在。間接熒光技術(shù)可以用已知的抗原檢測未知的抗體，也可用已知的抗體測出未知抗原?，F以檢測流行性出血熱病毒抗體（IgM）為例介紹如下：
     （1）將待測病人血清加至抗原片（流行性出血熱病毒感染的Vero-E6細胞片）上，每個(gè)稀釋度加2孔，最后2孔加PBS做對照。將玻片放置濕盒中，37℃溫育60min。取出玻片，棄去反應液，用PBS洗滌5min，風(fēng)干。
     （2）加入1∶40稀釋的FITC標記的羊抗人IgM，37℃溫育60min。取出玻片，按步驟2洗滌，風(fēng)干。
     （3）PBS甘油封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察。陽(yáng)性結果：在細胞膜及細胞質(zhì)中可見(jiàn)顆粒狀熒光顆粒，細胞核呈紅色。
 

         注意事項：溫育時(shí)將玻片放在濕盒中，以防液體蒸發(fā)。選擇低溫、干燥、潔凈的環(huán)境風(fēng)干。

     （本文轉載丁香園）